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背景和目的:第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在含有EGFR敏感突变的非小细胞肺癌患者中具有显著的活性。然而,EGFR-TKI耐药在治疗约12个月后不可避免地出现。获得性耐药的机制,除了EGFR（T790M）的继发性突变（占50-60%）外,还不太清楚。在此,我们在体外模型和获得性EGFR-TKI耐药的临床标本中发现LncRNA H19的显著下调,我们的目的是探讨其在非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药中的作用。在我们的研究中,首先筛选得到了对EGFR-TKI产生获得性耐药的非小细胞肺癌组织中差异表达的基因,LncRNA H19。分析了其表达与临床病理学特征及与患者预后的关系,然后采用一系列细胞生物学实验技术和免疫缺陷小鼠移植瘤模型在体内、体外研究了H19低表达对EGFR-TKI耐药的影响,并结合分子生物学和生物信息分析,探究其中的分子机制。方法:一、临床样本中LncRNA H19的表达及预后分析1.采用LncRNA测序和实时荧光定量RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组织中LncRNA的表达,并检测H19的相对表达水平。2.q RT-PCR检测50例对EGFR-TKI敏感的NSCLC患者（治疗前）和15例对EGFR-TKI产生耐药性的患者组织中H19的表达水平。分析接受EGFR-TKI治疗的患者H19表达水平与无进展生存期（PFS）和客观应答率（ORR）的关系。二、H19低表达对肺癌细胞系厄洛替尼耐药的影响1.采用含有EGFR敏感突变的肺腺癌细胞系建立体外获得性厄洛替尼耐药模型,通过MTT实验以及q RT-PCR检测耐药细胞IC50值以及H19的表达。2.通过慢病毒感染建立了稳定表达的H19调低和过表达细胞系,并通过q RT-PCR验证。3.MTT法比较H19过表达细胞、H19调低细胞和对照细胞在厄洛替尼或吉非替尼作用下的细胞活性。4.克隆形成实验比较H19过表达细胞、H19调低细胞和对照细胞在厄洛替尼作用下的集落形成能力。三、H19低表达对EGFR相关信号通路及耐药相关的EMT调控的机制研究1.采用Western blot分析EGFR相关信号通路蛋白和EMT相关蛋白的表达。2.使用AKT抑制剂LY294002和厄洛替尼分别单独或共同处理细胞,检测细胞AKT通路蛋白表达情况,并进行MTT实验与克隆形成实验检测细胞在药物作用下的细胞活性以及克隆形成能力。四、H19通过与PKM2的相互作用调控AKT激活并影响耐药的机制研究1.采用RNA纯化技术分离染色质（Ch IRP）,LC-MS/MS法研究非小细胞肺癌细胞中H19相互作用蛋白。2.采用RNA免疫沉淀实验（RIP）验证PKM2与H19的相互作用。3.采用平行反应监测（PRM）法分离检测HCC827细胞中的PKM2多肽,验证Ch IRP实验RNA结合蛋白。4.采用LncRNA荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光染色（IF）分别检测H19和PKM2在细胞内的定位。5.环己酰亚胺（CHX）追踪实验检测H19过表达细胞、H19调低细胞和对照细胞的PKM2降解。6.体外泛素化实验检测H19是否通过泛素化介导的降解下调PKM2表达。五、小鼠移植瘤模型体内验证H19下调对厄洛替尼耐药的影响1.采用人源肿瘤细胞移植（CDX）模型,体内验证H19低表达对EGFR-TKI耐药的影响。2.免疫组织化学（IHC）染色检测小鼠组织中Ki-67、PKM2和Cleaved-Caspase3的表达。六、统计分析统计分析采用SPSS Version 22.0软件,图形生成采用Prism Version 7.0（Graph Pad）。两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析（ANOVA）。结果:一、临床样本中LncRNA H19的表达及预后分析1.LncRNA-seq检测到在EGFR-TKI获得性耐药的非小细胞肺癌组织中LncRNA H19表达显著下调。2.q RT-PCR检测发现获得性耐药的肺癌组织样本中H19表达水平低于EGFR-TKI治疗前组织样本。3.Kaplan-Meier生存分析和log-ranch检验显示,低H19水平与较短的无进展生存期（PFS）显著相关。4.H19低表达组的客观应答率（ORR）显著低于高表达组。5.多因素Cox回归分析显示,H19表达水平是影响PFS预后的独立因素。二、H19低表达对肺癌细胞系厄洛替尼耐药的影响1.MTT法验证耐药细胞系的建立,并通过q RT-PCR检测到H19在厄洛替尼耐药细胞系中的表达较亲代细胞下调。2.MTT实验与平板克隆实验发现,与对照细胞相比,肺腺癌细胞中H19表达的调低降低了细胞对厄洛替尼和吉非替尼的敏感性,H19过表达作用相反。三、H19低表达对EGFR相关信号通路及耐药相关的EMT调控的机制研究1.H19调低表达减弱,H19过表达增强厄洛替尼对p AKT的抑制作用。H19过表达细胞的PARP和Cleaved-Caspase3随着厄洛替尼浓度的增加而增加,而在H19调低表达的细胞中则降低。2.AKT抑制剂（LY294002）恢复了H19调低细胞和耐药细胞对厄洛替尼的敏感性。3.耐药细胞系发生了明显的EMT现象,而当耐药细胞系过表达H19后,H19的表达不管是在细胞的形态上还是E-cadherin以及Vimentin的表达上都逆转了厄洛替尼耐药细胞的EMT表型。四、H19通过与PKM2的相互作用调控AKT激活并影响耐药的机制研究1.M2型丙酮酸激酶（PKM2）是质谱鉴定和平行反应监测实验检测出的H19相互作用蛋白之一。2.RNA免疫沉淀实验进一步证实PKM2与H19的相互作用。3.RNA FISH-IF分析表明,H19与PKM2共定位于细胞质中。4.在含有EGFR敏感突变的肺腺癌细胞中,H19调低增加PKM2蛋白水平,而H19过表达降低PKM2蛋白水平,PKM2在耐药细胞系中的表达高于亲代细胞。5.环己酰亚胺（CHX）追踪实验和体外泛素化实验表明,H19通过泛素化介导的降解调控了PKM2蛋白的表达。6.抑制PKM2的表达可以抑制H19下调引起的p AKT水平升高,恢复细胞对厄洛替尼的敏感性。7.H19的m RNA水平和PKM2蛋白水平在非小细胞肺癌组织和癌旁组织中的表达呈负相关。五、小鼠移植瘤模型体内验证H19下调对厄洛替尼耐药的影响1.人源细胞异种移植（CDX）模型和Western blot结果表明,H19下调通过抑制AKT通路的激活而产生对厄洛替尼的耐药性。2.免疫组化分析显示H19过表达使Ki67和PKM2表达降低,Cleaved-Caspase-3表达增加,H19调低表达作用相反。结论:在我们的研究中,证实了对第一代EGFR-TKI产生获得性耐药的非小细胞肺癌临床样本和细胞系中,LncRNA H19显著下调。在体外和体内模型中,抑制H19的表达均能够导致EGFR-TKI耐药的产生。H19通过与PKM2的相互作用促进AKT磷酸化并影响耐药相关的EMT导致EGFR-TKI的耐药性。在接受EGFR-TKI治疗的EGFR突变患者中,低H19水平与较短的无进展生存期（PFS）相关（P=0.021）。这些发现揭示了低水平的H19在EGFR-TKI获得性耐药中的新机制。并为在一些EGFR突变的NSCLC患者中联合使用EGFR-TKI和AKT抑制剂来克服EGFR-TKI耐药提供了一种潜在的途径。