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目的:研究蒙药朱日很滴丸抗动脉粥样硬化(AS)的作用及机制。方法:1蒙药朱日很滴丸发挥抗动脉粥样硬化作用的研究。将60只日本大耳白兔适应性喂养一周后,随机分为6组:溶媒对照组(Control)、模型组(Model)、朱日很滴丸高剂量组(HZRH,1160mg/kg)、朱日很滴丸中剂量(MZRH,367mg/kg)、朱日很滴丸低剂量组(LZRH,116mg/kg)、普罗布考组(Probucol,26mg/kg)。采用高脂饲料喂养结合牛血清白蛋白注射(250 mg/kg)的方法干预日本大耳白兔,建立AS动物模型。第8周造模成功后,在模型组的喂养基础上,朱日很滴丸组分别灌胃给予各剂量朱日很滴丸,每天一次,连续4周;普罗布考组灌胃给予普罗布考溶液,每天一次,连续4周;第12周处死。检测以下指标:(1)造模期间的第1、2和7、8周测定兔摄食量变化,体质量变化;(2)在造模开始至给药过程中的第0、4、8、12周测定各组血清中总胆固醇(CHOL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三脂(TG)及高密度脂蛋白(HDL)的含量;(3)通过油红O染色法,观察主动脉斑块覆盖率;(4)通过苏木素-伊红(HE)染色观察血管平滑肌增生及内膜病理改变。2蒙药朱日很滴丸抗氧化应激作用的研究。(1)通过Elisa法测定方法“1”中第12周各组血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活力,丙二醛(MDA)、氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)的含量;(2)以氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共孵育建立动脉粥样硬化血管内皮损伤模型,同时给予朱日很滴丸含药血清进行干预。实验共分为7组:空白组(Control)、模型组(Model)、空白血清组(VSC)、朱日很滴丸高剂量含药血清组(HZRHS)、朱日很滴丸中剂量含药血清组(MZRHS)、朱日很滴丸低剂量含药血清组(LZRHS)、维生素C对照组(Vit C)。(1)采用MTS法测定细胞存活率,确定ox-LDL损伤HUVEC所用的浓度与时间;(2)采用MTS法测定细胞存活率,考察ZRH含药血清对HUVEC发挥保护作用时各剂量组的用量与作用时间;(3)采用MTS法测定细胞存活率,考察ZRH含药血清各剂量对经ox-LDL损伤的HUVEC保护作用;(4)采用流式细胞术分析ZRH含药血清对经ox-LDL损伤的HUVEC凋亡的影响;(5)采用流式细胞术分析ZRH含药血清对经ox-LDL损伤的HUVEC细胞周期的影响;(6)采用Elisa法检测ZRH含药血清对经ox-LDL损伤的各组HUVEC中HO-1的表达量和SOD的活力。3蒙药朱日很滴丸抗氧化应激作用与Nrf2信号通路相关性的研究。对方法“2-(2)”中HUVEC做如下检测:(1)采用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测HUVEC中Nrf2的m RNA水平;(2)采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组HUVEC中Nrf2蛋白的表达量;(3)采用蛋白免疫印迹法检测HUVEC中细胞质与细胞核中Nrf2蛋白的表达量;(4)采用细胞免疫荧光法检测各组HUVEC中Nrf2的核转位情况;(5)加入Nrf2的干扰RNA(si RNA),采用MTS法检测ZRH含药血清对HUVEC存活率的影响,进一步探讨朱日很滴丸发挥抗氧化应激作用与Nrf2信号通路的相关性。结果:1蒙药朱日很滴丸发挥抗动脉粥样硬化作用的研究。(1)造模期间兔摄食量与体质量变化:与Control组相比,Model组、ZRH各剂量组、Probucol组的摄食量显著降低(P<0.05),但其体质量无明显不同(P>0.05)。(2)通过全自动生化分析仪检测0、4、8、12周各组兔血清中TG、CHOL、LDL、HDL的含量:于第8周时,与Control组相比,Model组TG、CHOL、LDL均显著升高(P<0.01),表明兔动脉粥样硬化模型建立成功。于第12周ZRH组给药结束后,与Model组相比,ZRH各剂量组血清中TG、LDL、CHOL的含量低于Model组,HDL的含量高于Model组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)通过油红O染色法观察主动脉斑块覆盖率:与Model组相比,ZRH各剂量组主动脉的斑块覆盖率显著减少,差异有统计学意义(P<0.01)。(4)通过HE染色观察血管内膜病理改变:与Model组相比,HZRH组细胞排列较整齐,平滑肌增生不太明显,内膜层泡沫细胞较少,病变较轻,MZRH、LZRH组相应病变均有减轻。2蒙药朱日很滴丸抗氧化应激作用的研究。(1)通过Elisa法检测AS模型兔血清中MDA、ox-LDL的含量和SOD的活力:与Model组相比,ZRH各剂量组血清中MDA的含量显著降低,差异均有统计学意义(HZRH:P<0.01,MZRH:P<0.01,LZRH:P<0.05);ox-LDL的含量显著降低,差异均有统计学意义(HZRH:P<0.01,MZRH:P<0.01,LZRH:P<0.05);SOD的活力显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。(2)(1)通过MTS法测定HUVEC活力,最终选用200μg/m L的ox-LDL作用于HUVEC 12h作为HUVEC最佳损伤条件。(2)通过MTS法测定HUVEC活力,最终选用20%的各剂量ZRHS孵育HUVEC 24h作为考察ZRHS对HUVEC保护作用的最佳条件。(3)通过MTS法测定HUVEC活力,与Model组相比,ZRH各剂量含药血清组均能显著提高细胞存活率(P<0.01),且各组间呈剂量依赖性。(4)通过流式细胞术检测ZRH含药血清对受损HUVEC凋亡的影响:与Model组相比,ZRH各剂量含药血清组均能显著降低细胞凋亡率(HZRHS:P<0.01,MZRHS:P<0.05,LZRHS:P<0.05),且各组间呈剂量依赖性。(5)通过流式细胞术检测ZRH含药血清对受损HUVEC周期的影响:与Model组相比,HZRHS组能显著提高细胞中处于S+G2/M期细胞的比率,能够促进细胞的增殖(P<0.01),MZRHS、LZRHS没有显著变化(P>0.05)。(6)通过Elisa法检测各组HUVEC中HO-1的表达量和SOD的活力:与Model组相比,ZRH各剂量含药血清组均能显著提高细胞中HO-1表达量、SOD的活力,差异均有统计学意义(P<0.01),且各组间呈剂量依赖性。3蒙药朱日很滴丸抗氧化应激作用与Nrf2信号通路相关性的研究。(1)采用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测各组HUVEC中Nrf2的m RNA水平:与Model组相比,ZRH各剂量含药血清组中m RNA水平显著上升(P<0.05),呈剂量依赖性。(2)通过蛋白免疫印迹法(western blot)检测各组HUVEC中Nrf2蛋白的表达量:与Model组相比,ZRH各剂量含药血清组细胞中Nrf2蛋白含量均显著上升,差异有统计学意义(P<0.01),呈剂量依赖性。(3)通过蛋白免疫印迹法(western blot)检测各组HUVEC中细胞质与细胞核中Nrf2蛋白的表达量:与Model组相比,ZRH各剂量含药血清组细胞质中Nrf2蛋白含量显著上升,差异有统计学意义(HZRHS:P<0.01,MZRHS:P<0.01,LZRHS:P<0.05),呈剂量依赖性;HUVEC细胞核中Nrf2蛋白含量显著上升,差异有统计学意义(P<0.01),呈剂量依赖性。(4)通过细胞免疫荧光法检测各组HUVEC中Nrf2的核转位情况:与Model组相比,ZRH各剂量含药血清组细胞核中Nrf2表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05),呈剂量依赖性。(5)加入Nrf2的干扰RNA(si RNA),通过MTS法检测ZRH含药血清对HUVEC的保护作用:与Model组相比,si RNA+HZRHS、si RNA+MZRHS、si RNA+LZRHS组未能显著提高细胞存活率(P>0.05),表明朱日很滴丸主要通过调节Nrf2信号通路发挥抗氧化应激作用。结论:蒙药朱日很滴丸可能主要基于Nrf2信号通路发挥抗氧化应激作用进而表现出抗动脉粥样硬化作用。