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本文以半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）为研究对象,利用同源克隆和RACE方法获得了半滑舌鳎两种leptin基因（lepa和lepb）及一种受体基因lepr的全长cDNA序列。采用实时荧光定量PCR技术检测了leptin及其受体基因的组织分布特征、早期生长发育过程和生殖周期的时空表达特性。最后,利用原核表达技术实现了半滑舌鳎lepa和lepb体外重组表达和生物活性检测,获得了具有生物活性的重组蛋白。本研究结果为全面认识半滑舌鳎生长发育与生殖机能的调控机制提供了新的基础资料积累。1.半滑舌鳎leptin及其受体基因的克隆和组织表达分析获得了半滑舌鳎两种leptin基因（lepa和lepb）及一种受体基因lepr的全长cDNA序列。lepa和lepb的cDNA全长为1265 bp和1157 bp,分别编码160个氨基酸和158个氨基酸,其空间结构具有较强的保守性。lepr的cDNA全长为4576 bp,编码1133个氨基酸。系统发育分析表明半滑舌鳎LepA、LepB和LepR与棘鳍总目鱼聚为一支。lepa mRNA在卵巢和脑中高表达。lepb mRNA在各组织中均检测到表达,表明其可能具有较为广泛的生理作用。lepr mRNA在卵巢中表达水平最高,在垂体、鳃和肾中表达水平较低,表明leptin及其受体可能在卵巢生理功能调控方面起着重要的生理作用。2.半滑舌鳎leptin及受体基因在早期生长发育过程中的表达特性检测了半滑舌鳎两个leptin基因和一个受体基因在未受精卵和胚胎发育过程的表达特性,结果显示:在未受精卵和不同胚胎发育时期都检测到leptin及其受体基因表达。lepa mRNA表达水平在桑椹胚、胚体包卵黄囊1/2、胚体包卵黄囊2/3期显著高表达,其它各发育期表达水平无显著差异。lepb和lepr mRNA表现出相似的表达水平变化趋势,lepb mRNA表达水平在桑葚期显著升高,同时在未受精卵中也较高,而lepr mRNA表达水平在在囊胚期和桑葚胚期显著升高,其它各时期未有显著差异。另外,还同步检测了GH、IGF-I和IGF-II等三个关键生长因子在未受精卵和不同胚胎发育时期的表达情况。偏相关分析显示,在胚胎发育阶段,lepr mRNA表达水平与IGF-I和IGF-II mRNA表达水平之间呈显著负相关关系,表明leptin及其受体和生长关键因子通过协同或者拮抗的方式共同参与了半滑舌鳎胚胎发育过程中胚胎形成、器官发育的调控。在仔稚幼鱼生长阶段,lepa mRNA表达水平在10 dph时达到峰值,其后自15dpf显著降低。lepb mRNA表达水平在3 dph和6dph时显著升高,其后自20 dph显著升高并维持。lepr mRNA表达水平在30 dph时达到峰值。同时,分析了与GH、IGF-I、IGF-II mRNA表达水平的关系。偏相关分析显示,lepa mRNA表达水平和lepb mRNA表达水平呈显著负相关关系,与lepr、GH和IGF-II mRNA表达水平呈显著或极显著正相关关系。同时IGF-II mRNA表达水平又与lepr和IGF-I mRNA表达水平呈显著或极显著正相关关系,表明leptin及其受体及生长关键因子以正向协同或负向反馈方式在早期生长发育阶段起重要调控作用。3.半滑舌鳎leptin及其受体基因在卵巢发育不同阶段中的表达特性在卵巢发育不同阶段,脑、垂体和卵巢中lepa和lepr mRNA表达水平均显著高于lepb mRNA表达水平。脑中lepa mRNA表达水平（Blepa）显著高于lepb和lepr,lepa与lepb mRNA表达水平（Blepb）表现出类似的表达趋势,在III期和VI时显著升高,其它各期较低;lepr mRNA表达水平（Blepr）在II和VI期卵巢时较高,而在III-V期较低。垂体中lepa mRNA表达水平（Plepa）与lepr（Plepr）变化趋势一致,在III期卵巢时最低,在IV-VI期显著调高;lepb mRNA表达水平（Plepb）在III期卵巢时达峰值。卵巢中lepa（Olepa）与lepr mRNA表达水平（Olepr）显著lepb,且表现出类似的表达变化趋势,在II和VI期相对较高,而在IV-V期达最低。偏相关分析系显示:Blepa mRNA表达水平与Blepb、Plepb、Olepb、Olepr之间呈极显著正相关关系,与Plepa、Plepr之间呈显著或极显著负相关关系。Blepb与Blepr、Olepa、Olepb、Olepr相互之间呈极显著正相关关系。Plepa与Plepr呈极显著正相关关系,与Olepa、Olepb、Olepr之间呈显著或极显著负相关关系。血清中E2表达水平（SE2）从II期卵巢开始显著升高,至IV期达峰值。血清中T表达水平（ST）从II期卵巢开始逐渐升高,在V期达峰值。血清中FSH（SFSH）、LH（SLH）、leptin（Sleptin）表达水平变化趋势基本一致,自II期卵巢开始逐渐升高,至IV期卵巢时达峰值。偏相关性分析显示:Sleptin、SE2、ST、SFSH、SLH之间呈显著或极显著正相关关系。这些结果表明,leptin及其受体在转录和血清水平上以协同或者拮抗的方式共同参与了卵巢发育。4.半滑舌鳎两种leptin基因的体外重组表达和生物活性分析根据半滑舌鳎lepa和lepb编码氨基酸序列合成开放阅读框ORF肽段。利用原核表达载体pEQ30成功构建了lepa/pQE30和lepb/pQE30重组质粒,分别转化至大肠杆菌M15后经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的LepA和LepB重组蛋白。获得的重组蛋白大小均为16 kDa,37°C下用0.5 mM的IPTG诱导4 h后目的蛋白表达量最高,主要以包涵体形式存在。检测LepA和LepB重组蛋白浓度分别为0.3mg/ml和0.25 mg/ml。Western-blotting免疫印迹和质谱分析表明,获得的LepA和LepB重组蛋白均具有免疫活性。Ni2+-NTA亲和层析柱纯化可获得高纯度的LepA和LepB重组蛋白。离体孵育实验表明,获得的LepA和LepB重组蛋白能显著抑制下丘脑lepa和lepb mRNA的表达水平,表明获得的重组蛋白具有明显的生物活性。