研究背景:皮肤刺激是指皮肤在受到刺激性物质作用时产生的一种反应,其主要表现为红肿、刺痛、瘙痒等症状。近年来,化妆品及化妆品原料种类的多样化,增加了诱发皮肤刺激的可能性;并且人们越来越重视护肤以及加深对皮肤刺激的了解,使得宣称舒缓功效的化妆品及化妆品原料逐渐受到人们的关注。目前现有的实验室舒缓功效评价方法大多是以炎症为指标,然而皮肤刺激是一个复杂的皮肤反应过程。虽然抑制炎症反应是评价原料舒缓功效的重要指标之一,但并不是唯一的评价指标。所以本研究拟建立一种全面、快速、高效并且不依赖抑制炎症反应的舒缓功效评价方法。研究内容:1、构建斑马鱼胚胎刺激模型。选用24 hours post-fertilization（以下简称:24 hpf）的AB系斑马鱼胚胎构建斑马鱼胚胎刺激模型,给予不同浓度的表面活性剂十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）和美白剂4-丁基间苯二酚（4-Butyl-resorcinol,4-BR）进行处理。在体式显微镜（带成像系统）下观察并记录斑马鱼胚胎的自旋运动情况,建立稳定的斑马鱼胚胎刺激模型。2、利用斑马鱼胚胎刺激模型评价化妆品原料的舒缓功效。选用24 hpf的AB系斑马鱼胚胎,分别给予不同浓度的甘草酸二钾、黄芩素、α-红没药醇、丹皮酚、积雪草苷、原花青素、4-叔丁基环己醇、茶多酚处理,根据斑马鱼胚胎的自旋运动情况和死亡率,确定原料的无可观察效应浓度（No observed effect concentration,NOEC）。然后利用斑马鱼胚胎刺激模型评价这八种原料的舒缓功效,根据斑马鱼胚胎的自旋运动情况,确定这八种原料的舒缓功效。3、化妆品原料舒缓功效的机理研究。使用Tg[lyz:Ds Red]系斑马鱼,给予100μmol/L SDS构建斑马鱼炎症模型;通过斑马鱼炎症模型评价甘草酸二钾、黄芩素、4-叔丁基环己醇的抗炎作用。使用AB系斑马鱼胚胎构建刺激模型,分别给予甘草酸二钾、黄芩素、4-叔丁基环己醇处理,在24 hpf制备RNA样品,然后使用RT-q PCR法检测相关的炎症因子的m RNA表达量,进一步探究斑马鱼胚胎刺激模型评价舒缓原料的机理与炎症的关系。研究结果:1、构建斑马鱼胚胎刺激模型。与空白对照组相比,500μmol/L SDS作用15 min时,斑马鱼胚胎的自旋运动次数明显增加。说明在该条件下SDS具有较强的刺激作用。综上所述,成功构建斑马鱼胚胎刺激模型,以用于下一步实验。2、利用斑马鱼胚胎刺激模型评价化妆品原料的舒缓功效。1000μmol/L甘草酸二钾、100μmol/L黄芩素、50μmol/Lα-红没药醇、200μmol/L丹皮酚、500μmol/L积雪草苷、1000μmol/L原花青素、150μmol/L 4-叔丁基环己醇以及3 g/L茶多酚确定为NOEC值。舒缓功效评价中发现,α-红没药醇、丹皮酚、积雪草苷、原花青素、茶多酚在高浓度下表现出较好的舒缓作用;甘草酸二钾、黄芩素、4-叔丁基环己醇在低、中、高三个浓度下均具有较好的舒缓作用。综上所述,利用斑马鱼胚胎刺激模型成功构建化妆品原料舒缓功效评价方法并通过该方法筛选出来的甘草酸二钾、黄芩素、4-叔丁基环己醇继续用于下一步实验的机理研究。3、化妆品原料舒缓功效的机理研究。500μmol/L、1000μmol/L甘草酸二钾和50μmol/L黄芩素在斑马鱼炎症模型中具有良好的抗炎作用;而200μmol/L、250μmol/L、300μmol/L 4-叔丁基环己醇在斑马鱼炎症模型中均没有抗炎作用。RT-q PCR结果显示,经500μmol/L SDS诱导后的24 hpf斑马鱼胚胎体内的白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）促炎因子没有明显变化;经过低、中、高剂量的甘草酸二钾、黄芩素、4-叔丁基环己醇处理后,斑马鱼体内的IL-6、TNF-α促炎因子同样没有明显变化。综上所述,斑马鱼胚胎刺激模型评价化妆品原料的舒缓功效可能是非炎症依赖的。总结:本课题通过斑马鱼胚胎自旋运动构建了一种化妆品原料舒缓功效评价的新方法,利用该方法对化妆品原料进行了舒缓功效评价;然后通过传统的斑马鱼炎症模型和RT-q PCR法验证了化妆品原料舒缓作用的途径不一定是炎症依赖的,因此本文构建的舒缓功效评价方法既可以用于筛选具有抗炎作用的舒缓原料,也可以筛选不具有抗炎作用的舒缓原料。本文通过观察斑马鱼胚胎自旋运动情况能直观反应化妆品原料的舒缓功效,为未来的化妆品新原料开发提供了一种快速、高效、高通量的评价方法。