饲用益生菌可以作为添加剂用以促进畜禽动物健康快速生长,其中枯草芽孢杆菌以其良好的抗逆性及产酶能力,同时能够消耗游离氧以维持肠道厌氧环境拮抗肠道有害菌群而被广泛应用。饲用益生菌作为活性微生物,需要严格的安全性评价,目前主要针对其潜在感染性、耐药性等方面展开研究。就饲用枯草芽孢杆菌而言,除了对其感染性和耐药性方面进行安全性评价,对于其潜在的产蜡样芽孢杆菌样毒素的风险也制定了相关评价方法,但是全面开展饲用枯草芽孢杆菌自身代谢物以及其引起畜禽代谢差异在食品安全性方面的研究依然相对滞后。因此本课题主要通过分离鉴定饲用枯草芽孢杆菌,测定饲喂枯草芽孢杆菌后对仔猪血清生化和免疫指标的影响,建立荧光定量PCR方法考察它对猪肠道主要菌群影响;同时建立LC/MS-IT-TOF方法,对枯草芽孢杆菌开展体外代谢研究以及它对猪消化道和可食性组织中代谢影响的研究,初步获得益生枯草芽孢杆菌在体外代谢和仔猪体内代谢过程中产生的差异代谢物信息,为后期对差异代谢物进行定性定量研究和进一步借助微生物代谢物组方法对饲用益生枯草芽孢杆菌代谢物方面开展食品安全性评价的研究奠定基础。1.枯草芽孢杆菌J1220分离鉴定及活性测定通过常规生理生化试验和PCR试验鉴定一种饲用益生菌产品中分离的枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis J1220;采用比浊法测定其生长曲线,并确定分离菌株在体外培养对数生长期末(24h)能够产生抗菌活性物质,对于金黄色葡萄球菌ATCC29312和大肠杆菌ATCC25922均有抑制作用,且对革兰氏阳性菌ATCC29213抑菌性更好;同时通过微量肉汤稀释法测定分离枯草芽孢杆菌J1220对常见23种抗菌药物的敏感性,发现枯草芽孢杆菌J1220对大部分常见抗菌药均敏感,对青霉素G和磺胺类药物耐药。2.枯草芽孢杆菌J1220对仔猪血清生化和免疫指标及肠道菌群影响研究选择12头体重20kg左右的三元杂交去势仔猪,建立仔猪回肠瘘管模型,经过术后护理及停药期后将其随机分为实验组和对照组,每组6头;实验组仔猪饲喂添加益生枯草芽孢杆菌制剂的基础日粮,对照组饲喂不添加益生菌的基础日粮,在饲喂后的第Od、7d、14d、28d采集血清测定主要生化和免疫指标,结果显示在第14d和28d,实验组血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、肌酸酐(CREA)浓度均显著增高(P<0.05),同时血清免疫指标IgG、IgM和IgA浓度也显著增大(P<0.05),而白蛋白与球蛋白比值则显著降低(P<0.05);第Od、3d、7d、10d、14d、28d分别采集两组动物回肠内容物和粪便,置于-70℃待检测,建立实时荧光定量PCR方法对样品中枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠杆菌、肠球菌的含量进行测定,结果表明随着实验组饲喂益生枯草芽孢杆菌的时间增加,肠道及粪便中检测的枯草芽孢杆菌数目也随着增多,实验组肠内容物和粪便中枯草芽孢杆菌的含量从第7d开始显著增多(P<0.01),在14d后时基本达到稳定状态,而对照组肠道与粪便中枯草芽孢杆菌的含量基本无明显变化;实验组肠内容物乳酸杆菌和双歧杆菌的含量从第7d开始显著增多(P<0.05),粪便中乳酸杆菌和双歧杆菌的含量从第10d开始显著增多(P<0.05);而肠杆菌和肠球菌的含量从第7d开始实验组肠内容物和粪便均显著低于对照组(P<0.05)。3.枯草芽孢杆菌J1220体外代谢研究建立枯草芽孢杆菌代谢物组的LC/MS-IT-TOF检测方法:首先通过对比样品出峰完整性及分离度确定LC/MS-IT-TOF的液相和质谱条件,然后根据单因素对照试验和正交试验确立提取溶剂和具体提取方案,考察方法的重复性后对试验枯草芽孢杆菌J1220体外培养对数生长期末发酵上清液中的代谢物提取测定,比较它与空白肉汤中的代谢物离子信息的差异;同时建立半体内模型考察分离枯草芽孢杆菌与肠道菌群体外共培养情况下差异代谢物离子信息情况。结果发现流动相选择A相:0.1%甲酸-水(V/V),B相:乙腈,采用梯度洗脱条件能够使离子峰出峰完全且分离良好;通过单因素对照试验确定了以体积比为1:1的乙酸乙酯和二氯甲烷混合溶剂,涡旋5min液液萃取的提取方法,方法重复性考察发现批内变异系数和批间变异系数小于15%,符合试验要求;试验在枯草芽孢杆菌J1220体外培养发酵上清液与空白肉汤中发现15种差异代谢物离子信息,分别是m/z 470.2441、474.9189、221.1185、277.1827、316.6631、340.1951、472.8264、453.2828、431.2678、409.2591、443.3213、501.8521、479.8179、460.2983、438.2803;同时建立半体内模型发现,与体外纯培养相比,当枯草芽孢杆菌J1220与肠道菌群共培养时,m/z 277.1827、340.1951、472.8264、431.2678、409.2591、443.3213、501.8521、479.8179、460.2983、438.2803、416.2708等代谢物信息完全检测不到,说明在肠道复杂条件下可能存在的差异代谢物与体外纯培养情况不一致,因此建立动物试验模型进一步验证。4.枯草芽孢杆菌J1220对仔猪代谢影响研究根据体外试验筛选的提取溶剂建立空白肠液、血浆和9种可食性组织样品前处理方法,并进行方法重复性考察;通过建立的仔猪回肠瘘管模型在实验组饲喂枯草芽孢杆菌J1220制剂后的第0d、3d、7d、10d、14d、28d分别采集两组动物回肠内容物和血浆,同时在第28d宰杀动物并采集肝脏、肾脏、肌肉、脂肪、心脏、肺脏、胃、小肠和大肠等可食性组织;采用建立的肠液、血浆及可食性组织样品前处理方法对动物试验样品样品处理,经过LC/MS-IT-TOF检测后以体外纯培养获得的15种代谢物离子信息为靶标提取离子流,考察枯草芽孢杆菌J1220对试验动物代谢影响。结果显示,建立的肠液、血浆和组织样品代谢物提取和检测方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于15%;检测仔猪回肠瘘管模型采集的肠液、血浆及可食性组织样品发现实验组和对照组肠液及血浆中的差异代谢物离子信息分别为m/z 470.2441和m/z 474.9189,实验组动物肠液第3d开始出现差异离子信息,血浆第7d开始出现差异离子信息;而实验组和对照组第28d组织样品中仅肝脏、肾脏、小肠、大肠中有明显的差异,肌肉和胃中离子信息响应相对较低,脂肪、心脏、肺脏中未提取到差异离子信息。综上所述,本课题分离并鉴定了益生枯草芽孢杆菌J1220,测定了其对于23种抗菌药敏感性以及抑菌活性;建立仔猪回肠瘘管模型现饲喂J1220益生菌制剂能够显著提高仔猪肠道有益菌群数量而抑制有害菌群数量,同时经过血清生化和免疫指标分析结果显示饲喂J1220制剂能够促进仔猪代谢水平及机体免疫机能;体外代谢物组分析发现15种差异代谢物离子信息,半体内和体内代谢物组结果显示实验组仔猪肠内容物、血浆及可食性组织中主要差异离子信息为m/z470.2441和m/z 474.9189。