丁酸是一种广泛应用于食品、化学和医药等行业的短链饱和脂肪酸,目前主要由石油炼制的方法合成。随着石油资源的日渐枯竭、化学合成对环境的污染日益严重以及人们对生物基产品的偏爱,利用产丁酸菌代谢生物质资源转化丁酸的微生物发酵法日益受到关注。本课题采用纤维床生物反应器(fibrous bed bioreactor,FBB)固定化酪丁酸梭菌发酵非粮原料和废弃生物量等廉价生物质,发展生物发酵法生产丁酸的新工艺。酪丁酸梭菌能有效代谢葡萄糖、木糖、果糖和蔗糖等碳源发酵生产丁酸。在FBB固定化批次发酵模式下,其代谢产丁酸的最适培养基组成是60 g/L碳源,10 g/L氮源,产率最高可达3.40 g/(L·h),廉价的玉米浆可作为工业化生产的替代氮源;而在FBB固定化补料流加发酵模式下,丁酸的终产量维持在45.4?53.92 g/L之间,得率维持在0.41?0.46 g/g,丁酸对乙酸的比率最高达25.7。木薯淀粉和木薯渣需先水解预处理。其中,在120°С、水解45 min、盐酸浓度为0.25 mol/L,淀粉浓度为10%的稀酸水解下,木薯淀粉的葡萄糖得率达98.81%,用于补料流加发酵生产丁酸的产量为49.95 g/L,得率为0.44 g/g。常压和加压下,稀酸水解木薯渣的总还原糖得率在56%左右。以木薯渣水解液为底物的批次发酵生产的丁酸产量和得率分别为23.20 g/L和0.44 g/g。甘蔗废糖蜜稀释后可直接用于发酵产丁酸,发酵最适pH为6.0,经盐酸法预处理可提高丁酸产量。采用补料流加发酵经盐酸处理的废糖蜜生产丁酸的产量达55.2 g/L,对乙酸的比率为21.23,同比批次发酵,分别提高了59.54%和1.39倍,得率高达0.47 g/g。进一步研究酪丁酸梭菌的糖转运机制,发现菌体含有依赖磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的葡萄糖-磷酸转移酶系统(PTS)和依赖ATP的葡萄糖激酶两种葡萄糖磷酸化系统。其中,依赖PEP的葡萄糖-PTS是组成型酶系,其功能的发挥需要细胞质和细胞膜两组分共同参与。经分离纯化,鉴定出细胞质组分中含有可溶性组氨酸蛋白(HPr)。同时,菌体含有依赖PEP的蔗糖-PTS磷酸化系统,它是诱导型酶系,其底物特异性蛋白存在于细胞膜结构中。采用酶联法测定出蔗糖-6-磷酸水解酶和果糖激酶的活力,由此推断出酪丁酸梭菌中蔗糖的代谢途径。为了优化菌体在FBB上的固定化,控制固定在FBB上细胞的活性,实现FBB的长期稳定发酵,考察了细胞在纤维质载体上的吸附机理和影响因素,包括菌体表面特性、生长阶段、溶液pH、离子种类、强度和培养基组成等。此外,载体经化学修饰后,菌体在载体表面的静态、动态吸附和解吸行为均发生了改变。最后,提出优化的固定化方法。采用FBB固定化反复补料流加模式发酵葡萄糖时,最终丁酸产量达到86.9 g/L,是目前公开报道发酵法生产丁酸的最高产量,对葡萄糖的得率为0.46 g/g,丁酸产率为1.1 g/(L·h)。经FBB长期适应性驯化后的菌体在细胞表型和生物化学特性方面较之原始菌均发生了改变。由此提出,FBB适应性驯化不仅是实现酪丁酸梭菌高产丁酸的有效手段,还可作为一种获得高活力和耐受产物抑制能力显著提高的驯化菌的、具有普遍意义的育种策略。