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复方丹参方是临床最常用的治疗血瘀性冠心病的中药制剂之一,具有确切的抗动脉粥样硬化作用。因动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,炎症因子(如TNF-α)可促进其发生发展。内皮细胞在动脉粥样硬化的早期扮演了至关重要角色,本研究以内皮细胞损伤为切入点,考察复方丹参方主要活性单体对血管内皮细胞分泌PAI-1,NO,粘附分子和ET-1的影响,以期进一步明确复方丹参抗动脉粥样硬化的物质基础及其药理作用分子机制。 首先进行了复方丹参方活性单体对内皮细胞一氧化氮释放刺激筛选实验,丹参酮Ⅰ(0.33-3μM),丹参酮ⅡA(1-9μM)和隐丹参酮(1-9μM)能够呈剂量依赖的刺激内皮细胞一氧化氮的释放,因为有文献报道一氧化氮可以抑制内皮细胞的ET-1分泌。利用ELISA法和RT-PCR法,进一步筛选了丹参酮对ET-1的抑制作用,发现隐丹参酮(1-9μM)可以呈剂量依赖抑制基础水平及TNF-α损伤情况下内皮细胞内皮素-1蛋白的分泌和mRNA的表达。以EMSA法测定转录因子活性发现隐丹参酮的抑制ET-1作用与NF-κB通路有关。 运用免疫酶联技术检测,发现了复方丹参方中水溶性单体原儿茶醛(0.15-0.45mM)、丹酚酸B(0.017-0.15μM)呈剂量依赖性地抑制人血管内皮细胞在TNF-α损伤情况下PAI-1分泌和细胞表面粘附分子(VCAM-1,ICAM-1)的表达。细胞粘附实验表明,原儿茶醛可以抑制单核细胞在内皮细胞表面的粘附。结合EMSA法和通路特异性抑制剂作用叠加分析分子通路作用研究表明,原儿茶醛、丹酚酸B的保护内皮细胞功能都与动脉粥样硬化关键转录因子NF-κB和AP-1有关。JNK通路抑制物SP600125可以叠加丹酚酸B的抑制PAI-1活性,而NF-κB抑制物emodin和ERK通路抑制物PD98059不能叠加丹酚酸B的抑制PAI-1作用,说明丹酚酸B除抑制NF-κB外,还通过ERK通路抑制转录因子AP-1活性的。 这些结果说明复方丹参方通过多种组份作用于多个靶点而发挥其抗动脉粥样硬化作用。初步揭示复方丹参方主要活性成分的作用途径和复方丹参方治疗血瘀证的“方一证”关系的科学内涵。