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目的:研究miR-322在胚胎干细胞向心肌细胞定向分化中的作用与机制,miR-322通过何种途径对胚胎干细胞向心肌细胞的分化起到调控作用。本实验以小鼠胚胎干细胞为研究对象,预测celf1为miR-322靶基因,利用慢病毒对miR-322、celf1进行过表达与敲减,研究miR-322、celf1在胚胎干细胞向心肌细胞的定向分化的作用、以及二者间的相互影响。我们希望通过本研究的深入,为心肌损伤临床防治提供新思路、新靶点和新方向,为miR-322在心血管疾病中甚至更多其他疾病的应用提供更多的理论依据与治疗方法。方法:1、MEF细胞与mES-D3细胞的传代培养:MEF细胞传代于P3代以Mitomycin C处理。在以MEF细胞为饲养层的条件下,使mES-D3细胞稳定传代。2、慢病毒载体的制备,慢病毒转染。将携带目的基团与抗性筛选基因、荧光基团的质粒装载进入慢病毒中,并预先测得的最佳转染条件,将病毒转染mES-D3细胞;之后经过抗性筛选,提高转染效率。3、mES-D3细胞分5组进行分化。将细胞分成5组:(1)过表达miR-322与野生细胞、空病毒组;(2)敲减miR-322与野生细胞、空病毒组;(3)过表达celf1与野生细胞、空病毒组;(4)敲减celf1与野生细胞、空病毒组;(5)miR-322、celf1同时过表达与野生细胞、空病毒组。通过经典的hanging drop的方法形成拟胚体(embryoid body),建立分化模型,并于分化开始后不同时间点进行样品收集。4、以western blot的方式进行抗体与免疫测定。按常规方法将蛋白样品转移至NC膜上。先后用Nkx-2.5、Celf1单克隆兔抗,GAPDH、cTnT鼠抗孵育及辣根过氧化物酶标记的IgG二抗进行孵育,增强荧光试剂显色。测定各实验组mES-D3细胞中celf1的表达,以验证病毒转染是否成功,再于各分化模型中第0,5,10天测定GAPDH、Nkx-2.5、cTnT。5、qRT-PCR分析。以各基因组D0天的EB表达水平作为标准对照,测定Oct-4、Sox-2、Nkx-2.5、MLC-2v、α-MHC、c TnT等基因在mES-D3细胞向心肌细胞分化中的变化。提取总RNA,将总RNA进行rt-PCR逆转录合成cDNA,cDNA于ABI公司7500荧光定量PC R仪中反应,待反应结束进行扩增曲线及溶解曲线计算,计算出2-△△Ct值,使用GraphPad Prism 5分析数据。6、免疫荧光(immunofluorescence)观察mES-D3细胞分化后的心肌细胞分布。将EB种板后,在固定天数将其洗涤、固定,在荧光下观察各组α-actinin的表达。结果:1、miR-322在心肌发育过程中起到关键作用(1)上调miR-322会显著促进心肌细胞的分化;(2)下调miR-322会抑制心肌细胞分化并影响心肌细胞成熟。2、Celf1是心肌发育中一个关键性的调控因素(1)Celf1的过表达将会使心肌细胞的分化受到抑制;(2)对celf1基因敲减,发现对心肌细胞发育有正向调节作用。3、Celf1是miR-322调控心肌分化的下游靶基因(1)在miR-322过表达实验组,celf1敲减实验组与miR-322、celf1同时过表达实验组,celf1(CUG-BP1)的表达有不同程度的下调。(2)miR-322、celf1同时过表达实验组的结果与celf1单独过表达实验组心肌标记物检测结果很相近。结论(1)miR-322对胚胎干细胞向心肌细胞分化有促正性调节作用。(2)Celf1对胚胎干细胞向心肌细胞分化有负性调节作用。(3)miR-322通过抑制Celf1表达来达到促进心肌细胞分化的作用。