论文部分内容阅读
背景:牙周病一直是人类口腔疾病中最常见的两大疾病之一[1],并且在我国,牙周病的患病率比口腔龋病的患病率更高[2].牙周炎是由牙周致病菌引起的慢性感染性疾病,以附着丧失和牙槽骨吸收为主要临床表现,牙周病治疗的最终目标是修复缺失的牙槽骨,恢复牙周组织生理结构和功能[3]。但就目前牙周治疗方法而言,牙周基础治疗能有效地控制牙周炎症,牙周手术、药物治疗、激光治疗等作为辅助手段依然不能有效地修复缺损的牙槽骨,恢复牙周组织结构和功能,在治疗伴牙槽骨缺失的牙周炎中,迫切的需要一种行之有效的方法,实现真正意义上的牙周组织再生,实现牙周生物学修复。近年组织工程技术迅猛发展,在口腔疾病研究中,牙周组织工程技术以具有促进成骨作用的生长因子、牙源性的干细胞和生物支架材料为三要素,为伴牙槽骨缺失的牙周炎的治疗提供了一种新思路[4-6]。牙源性干细胞中,牙囊干细胞是存在于牙胚周围牙囊组织中的干细胞,来源于间充质,能分化形成牙周支持组织,即牙槽骨、牙周膜和牙骨质[7]。牙囊干细胞具有自我更新和复制的能力,在特定诱导环境下能多向分化形成成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞和成神经细胞,作为牙周组织工程的种子细胞有一定优势。骨形成蛋白9(Bone Morphogenetic Protein 9,BMP9)作为骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)家族成员之一,在现已发现的有促成骨作用的BMPs中,拥有最强的促进成骨能力[8],将BMP9作为生长因子应用于牙周组织工程,具有极大地研究潜力和意义。CHA(Coralline Hydroxyapatite,CHA)来源于海洋珊瑚,具有天然的疏松多孔的结构,拥有良好的生物相容性[9],干细胞能在材料表面生长、增殖,并能作为骨材料用于修复骨组织缺损[10]。因此本研究以携带BMP9基因的腺病毒转染大鼠牙囊干细胞,在体外与CHA复合后形成组织工程化骨,探讨这种以BMP9、rDFCs、CHA为三要素的复合物治疗大鼠牙周骨缺损的作用。目的:1.应用酶组织块消化法和梯度离心法体外培养rDFCs,使携带BMP9基因的腺病毒稳定高效转染rDFCs。2.探讨CHA生物相容性,以及CHA对rDFCs成骨分化的作用。3.研究以BMP9、rDFCs和CHA作为组织工程三要素,治疗大鼠牙槽骨缺损的体内试验研究。4.探讨BMP9诱导rDFCs成骨分化过程中,Smad1/5/8信号通路的调控作用。方法:1.酶组织块消化法获得原代rDFCs,梯度离心消化法获得纯化的第三代rDFCs.2.电镜观察CHA表面形态,及rDFCs粘附与CHA表面生长、增殖状态,RT-q PCR探索CHA对rDFCs成骨因子表达、成骨分化的影响,探索CHA与rDFCs见生物相容性。3.Ad-BMP9转染rDFCs后与CHA形成组织工程化骨植入急性牙周骨缺损处,6周后通过Micro CT、组织切片染色观察牙槽骨新生情况。4.Smad1/5/8磷酸化阻断剂作用下,ALP染色、茜素红染色和及RT-q PCR观察BMP9诱导rDFCs成骨分化过程中,成骨相关因子表达情况。结果:1.原代牙囊干细胞形态呈多样性,以长梭形和多角形为主,经梯度消化离心传代后的第三代rDFCs主要以长梭形为主,内含1-3个细胞核,胞浆丰富,高倍镜下可见高密度颗粒影像。Ad-BMP9转染rDFCs后,镜下观察rDFCs稳定表达绿色荧光。2.扫描电镜下观察CHA结构,CHA呈现疏松多孔结构,相互联通,孔隙大小在100-600μm。rDFCs能稳定牢固地在CHA表面生长、增殖、分泌细胞外基质。RT-q PCR结果提示,CHA能促进rDFCs表达成骨因子:OPN、ALP、Osterix,促进rDFCs向成骨细胞分化。3.Micro CT数据分析结果及HE染色结果提示,BMP9转染的rDFCs与CHA复合后形成的组织工程化骨植入牙槽骨缺损处6周后,相较于单纯的CHA植入和rDFCs/CHA植入组,实现了更多的骨组织再生。4.Compound C作为Smad1/5/8磷酸化的阻断剂,也能阻断BMP9诱导rDFCs成骨分化过程中Smad1/5/8磷酸化。BMP9诱导rDFCs成骨分化及表达成骨因子过程中,受Smad1/5/8信号通路调控。结论:通过酶组织块消化法能获得呈多形性的牙囊干细胞,梯度消化离心法能获得纯化的第三代rDFCs,细胞呈长梭形,胞质内含1-3个细胞核,并可见胞浆内含有高密度颗粒。CHA有用良好的生物相容性,rDFCs能稳定牢固地在CHA表面粘附、增殖和分泌细胞外基质,并且CHA能促进rDFCs成骨向分化,促进成骨因子表达。以BMP9、rDFCs和CHA作为组织工程的三要素,Ad-BMP9基因转染rDFCs后与CHA复合形成组织工程化骨的方式能有效的促进牙周骨组织的生成。本实验研究为BMP9、rDFCs应用于牙周组织再生提供理论依据,也为组织工程技术应用于牙周组织再生提供支持。