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环糊精葡萄糖基转移酶（简称CGT酶,EC 2.4.1.19）可通过环化反应转化淀粉或其衍生物合成环糊精。常见的环糊精为α-、β-和γ-环糊精,分别由6、7或8个葡萄糖构成。环糊精可和众多客体分子形成包合物,改善其理化性质。目前,常选用单一类型环糊精与客体分子包合,而野生型CGT酶转化淀粉的产物多为三类环糊精混合物,需经过复杂的分离纯化来获取单一环糊精,因此限制了其规模化生产与应用。本论文针对CGT酶制备环糊精产物特异性差这一问题,对CGT酶底物结合亚位点进行分子改造,优化了α-环糊精和γ-环糊精的制备工艺以及γ-CGT酶发酵工艺。主要研究结果如下:（1）-7亚位点对产物特异性的影响。通过序列及结构分析,鉴定了Peanibacillus maceransα-CGT酶的-7亚位点,设计并获得多个突变体,其中单突变D147A、R146P、D147P和双突变R146A/D147P、R146P/D147A、R146P/D147P的β-环糊精的合成比活力显著降低,产物α-环糊精比率由野生型的63.2%分别提升至68.8%、71.4%、73.0%、75.1%、76.1%和76.8%。结合结构分析,提出在-7亚位点处引入脯氨酸残基封闭氨基酸骨架-NH-与糖单元氢键以降低β-环糊精形成,进而提高α-环糊精比率的设计改造策略,并在Bacillus stearothermophilus NO2来源的α/β-CGT酶中得到验证,α/β-CGT酶突变体E142P和T143P产物α-环糊精比率由野生型的39.5%上升到53.0%和48.7%。（2）-3亚位点对CGT酶产物特异性的影响。通过序列及结构分析,设计并获得47位和94位的多个突变体（以B.circulans 251来源β-CGT编号为依据）。在47位点处,P.maceransα-CGT酶突变体K47T的α-环糊精合成比活力显著降低,γ-环糊精合成比活力显著上升,产物α-环糊精的比率由55.5%降为39.0%,γ-环糊精的比率由12.9%提升至17.0%;B.circulans 251β-CGT酶突变体R47T的β-环糊精合成比活力显著降低,γ-环糊精合成比活力显著上升,产物γ-环糊精的比率由16.2%提升至19.3%。上述结果表明,47位长侧链氨基酸R或K侧链的移除降低了CGT酶环化活性,但有利于γ-环糊精的生成。在94位点处,B.clarkiiγ-CGT酶突变体F91N、F91L的三种环糊精合成比活力显著上升,产物γ-环糊精的比率由野生型的77.1%降为61.4%和62.9%;P.maceransα-CGT酶突变体N94W和B.circulans 251β-CGT酶突变体N94W环化活性显著降低,产物γ-环糊精比率分别由12.9%和16.2%提升至23.4%和25.7%,结果表明,当94位为小侧链氨基酸时有利于CGT酶的环化反应活性,当94位为大侧链氨基酸时,不利于CGT酶的环化反应活性,但有利于产物γ-环糊精的生成。（3）中心亚位点、-7亚位点以及与-3亚位点的组合突变对CGT酶产物特异性的影响。通过序列及结构分析,设计并获得多个突变体。在中心亚位点处,P.maceransα-CGT酶突变体Y195W和B.circulans 251β-CGT酶突变体Y195W环化活性显著降低,产物中γ-环糊精比率由12.9%和16.2%分别上升至17.0%和19.3%。B.clarkiaγ-CGT酶突变体Y186W的产物中γ-环糊精比率由77.6%上升至94.6%。在-7亚位点,P.maceransα-CGT酶和B.circulans 251β-CGT酶突变体Δ（145-151）D产物γ-环糊精比率由12.9%和16.2%分别上升至21.4%和33.7%。采用-7亚位点疏通长链结合空间,-3亚位点限制弯曲构象及中心位点增大被包埋侧链的亚位点改造策略,设计的组合突变体N94W/Δ（145-151）D/Y195W产γ-环糊精比率由12.9%和16.2%分别上升至40.3%和45.1%。（4）复合剂对CGT酶及其突变体制备环糊精的影响。研究不同种类的醇类和环状复合剂对CGT酶及其突变体制备环糊精的影响。结果表明,在α-环糊精的制备中,当采用低沸点的正辛醇为复合剂时,P.maceransα-CGT酶和突变体R146R/D147A环糊精总转化率分别为56.6%和53.5%,其中α-环糊精比率分别为73.8%和89.7%,表明选用低沸点的正辛醇为复合剂制备α-环糊精时突变体R146R/D147A更具备优势。在γ-环糊精的制备中,以环十二酮为复合剂时,采用B.clarkiaγ-CGT酶和突变体Y186W环糊精总转化率分别为74.4%和72.8%,其中γ-环糊精比率分别为88.3%和96.6%,表明突变体Y186W制备γ-环糊精优于野生型酶。（5）小分子伴侣对大肠杆菌生产γ-CGT酶的影响。通过筛选小分子伴侣及发酵条件优化,发现培养基中添加环糊精可有效降低γ-CGT酶包涵体形成、提高可溶表达。摇瓶发酵中,当添加β-环糊精浓度为7.5 mM时,γ-CGT酶总酶活最高为5.51 U·mL-1,是对照组的1.95倍。在3L发酵罐中,添加7.5 mMβ-环糊精,乳糖0.3 g·L-1·h-1,γ-CGT酶总酶活可达到50.29 U·mL-1,是对照组1.71倍。