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组蛋白甲基化修饰是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式。近年来,动植物中多个组蛋白甲基转移酶被鉴定,组蛋白赖氨酸甲基转移酶基囚也相继被分离克隆,研究发现其共同特征是具有SET结构域,功能研究显示它们在基因表达调控、生物体的生长发育和细胞的命运决定等方面具有重要调控作用。然而,水稻作为重要的粮食作物,同时又是重要的单子叶模式植物,有关组蛋白甲基化如何调控水稻的基因表达及影响水稻生长发育的相关研究还很少。本论文采用生物化学、细胞生物学、遗传学和分子生物学等手段研究了水稻中一个编码组蛋白H3K9甲基转移酶的性质和功能。
水稻基因组中有38个编码SET结构域蛋白的基因,生物信息学分析发现SDG714基因(编码SET结构域蛋白,编号714)编码的蛋白与已知的组蛋白H3K9甲基转移酶KRYPTONITE(KYP)具有较高的同源性,并且均含有保守的pre-SET,SET和post-SET结构域,推测SDG714可能具有甲基转移酶活性。为此,我们分离克隆了SDG714基因。SDG714编码663个氨基酸,位于C端含有pre-SET,SET和post-SET结构域,同时含有一个YDG结构域。体外生化实验研究发现,SDG714能够将3H标记的SAM(S-adenosyl-[methyl-3H]-L-methionine,甲酰甲硫氨酸)转移到核心组蛋白和寡聚核小体上,表明SDG714具有组蛋白甲基转移酶活性。如果将H3N端(1-57aa)的第4、9和27位的赖氨酸突变为精氨酸残基后,发现SDG714不能将3H标记的SAM转移至第9位突变的赖氨酸底物上,表明SDG714具有H3K9的位点特异性。将SDG714的N端和YDG结构域删除后的SDG714C端部分(pre-SET、SET、post-SET部分,319-663aa),生化实验发现,SDG714C仍然具有甲基转移酶活性和H3K9甲基化位点特异性,表明SDG714C末端的pre-SET、SET、post-SET包含了组蛋白甲基转移酶的活性结构域和位点特异性结构域。
细胞学研究发现,SDG714-GFP融合蛋白能够定位于细胞核中,表明SDG714是一个核蛋白。如果将其NY端(N端和YDG结构域)删除以后,SDG714C则定位于细胞核和细胞质中,推测SDG714的定位信号位于N端或YDG结构域,观察SDG714NY(N端和YDG结构域部分)转化的拟南芥根部发现,SDG714NY还能定位于细胞核中,表明SDG714NY具有核定位信号,而只包含SDG714N端信号能够进入细胞核中,进一步说明其定位信号位于蛋白的N端。细胞学研究中发现,SDG714在细胞核心内呈点状分布,用DAPI染色发现,SDG714信号能够与异染色质完全重合,表明SDG714能够结合于异染色质上。
为了研究SDG714的体内生物学功能,我们采用了RNAi(RNAinterference)的方法,产生SDG714IR特异敲除的突变体。与对照相比,SDG714IR表型为大的表皮毛(macro-trichome)丢失,电镜扫描发现位于突变体颖壳、叶和茎的表面大的表皮毛完全缺失,但是小的表皮毛未受影响。植物体内的组蛋白甲化分析发现,位于突变体内的组蛋白H3K9甲基化水平与对照相比没有降低,表明SDG714并不能影响整体组蛋白甲基化修饰。Tos17是一类copia类逆转座子,在水稻体内处于沉默状态,而通过长时间的组织培养可以诱导使其处于活跃状态,而再生水稻植株中Tos17又恢复沉默状态。本研究发现Tos17位点处于异染色质状态,而SDG714IR突变体的组蛋白H3K9甲基化水平明显降低;同时,Tos17位点的CpG和CNG的甲基化水平明显降低。转录水平研究发现,Tos17的表达水平明显提高,检测突变体T0和T1代Tos17考贝数发现,在突变体的T1代中,Tos17的考贝数由T0代的2个考贝变为3-5个考贝,表明SDG714参与了Tos17的转座活性。
对突变体异染色质区CentO、5SrDNA和453rDNA位点甲基化分析发现,SDG714IR突变体内DNA甲基化水平明显降低。位于5SrDNA和45SrDNA位点的组蛋白甲基化水平也明显的降低。表明SDG714影响异染色质的功能和染色体的稳定性,H3K9组蛋白的甲基化控制DNA的甲基化这一特性,在水稻中同样具有保守性。
本研究明析了组蛋白甲基化,DNA甲基化和转座子之间的关系,首次阐述了组蛋白甲基化与转座子转座之问的关系,为水稻的表观调控重要性提供佐证,为水稻的表观遗传研究奠定基础,具有重要的理论依据和应用价值。