过去的十几年,得益于二代测序技术(next generation sequencing,NGS)的迅速发展,基于NGS的DNA突变检测技术不断发展成熟,但常规NGS的高错误率阻碍了其在检测低频突变中的应用。目前低频突变检测技术主要应用于检测循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA),然而血液中的cfDNA含量很少,以及包括DNA扩增和测序在内的实验过程会引入背景噪音,导致检测假阳性。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是由肿瘤细胞产生的一类cfDNA,基于ctDNA的突变检测可用于癌症筛查、基因分型、疾病实时监测。但是,在大多数早期和部分中晚期实体瘤中,ctDNA的含量非常低,造成对ctDNA的检测和生信分析变得极具挑战性。为了克服这些限制因素,我们基于Duplex Sequencing策略,结合基于机器学习的背景抛光技术和改进版分子条形码技术(home-developed unique molecular identifiers,dUMI),开发了一种cfDNA低频突变分析算法——Mutseek,可以将碱基总体错误率从0.034%降到了0.005%。我们对包含8个已知突变位点的DNA标准品进行检测,发现该方法可以检测低至0.1%水平的突变。我们将该算法应用于临床肺癌cfDNA样本中,对EGFR T790M突变进行无创检测,检出率达90%,进一步验证了算法的性能。我们运用Mutseek对dUMI数据分析发现,与目前国际上检测灵敏度前列的iDES技术相比,iDES样本表现出明显的G>T/C>A偏好性,可能是在杂交捕获步骤中DNA发生了氧化损伤引起的,我们的样本中并无这种碱基偏好性,说明我们的样本处理这一步骤更温和,背景噪音更低;另外我们发现dUMI和iDES的样本中都存在较明显的C>T/G>A偏好性,该现象可能是甲基胞嘧啶自发脱氨基导致的。另一个发现是,dUMI单独采取条形码处理时,碱基总体错误率低于iDES(0.008%VS 0.01%),而dUMI单独采取背景抛光处理时,碱基总体错误率也略低于iDES(0.0052%VS 0.0068%),但将两种技术进行组合时,我们的样本降噪后总体错误率高于iDES(0.0050%VS 0.0014%),没有显著的叠加效果,这可能是由于我们用于建模的健康人样本数据比iDES少造成的。总之,我们开发了一种基于高通量测序的生物信息分析算法,可以在标准品和临床样品中检测0.1%水平的低频突变。但算法还存在一些缺陷,首先,背景抛光模型不够完善,降噪模型并没有达到最优,后续需要更多临床健康人的数据,利用机器学习方法优化降噪模型,进一步提升检测灵敏度。其次,需要通过优化各个程序的运行时间来缩短整个分析周期,给临床患者争取更多的时间,得到更及时的治疗。