论文部分内容阅读
研究目的:抑郁障碍是促进肿瘤发生发展的重要因素,其作用机制与导致机体免疫抑制密切相关。机体的抗肿瘤免疫功能以细胞免疫为主,其中辅助性T淋巴细胞(CD4+T细胞,Th)发挥重要作用,其与细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)的比值(CD4/CD8)与机体的免疫功能调节密切相关,Th22细胞是新近发现的辅助性T细胞亚群,主要分泌细胞因子IL-22,其早期研究主要集中在炎症性疾病与自身免疫性疾病,在结直肠肿瘤微环境中的作用尚不清楚。本研究通过建立结直肠癌伴抑郁小鼠动物模型,检测CD4/CD8、Th22细胞及相关因子IL-22在结直肠癌的表达分布情况,深入探讨抑郁障碍对结直肠癌肿瘤生长的影响,帕罗西汀抗抑郁治疗对慢性应激合并肿瘤动物的作用及CD4+T细胞、Th22细胞及相关因子IL-22的变化情况,并探讨IL-22通过调控MAPK信号通路在小鼠结直肠癌伴抑郁模型中发挥的作用,为结直肠癌合并抑郁患者的肿瘤防治提供新的科学依据。研究方法:将80只BALB/c小鼠随机分组,采用皮下移植的方法接种体外培养的小鼠结直肠癌CT-26肿瘤细胞,建立小鼠结直肠癌模型,采用慢性不可预见性应激刺激建立结直肠癌伴抑郁动物模型,并对结直肠癌伴抑郁动物进行帕罗西汀抗抑郁及氟尿嘧啶化疗干预。根据研究目的将实验动物分组:单纯抑郁模型组(DD)、氟尿嘧啶化疗干预的肿瘤抑郁组(肿瘤抑郁化疗组CDF)、帕罗西汀干预的肿瘤抑郁组(肿瘤抑郁抗抑郁组CDP)、帕罗西汀加氟尿嘧啶化疗干预的肿瘤抑郁组(肿瘤抑郁抗抑郁+化疗干预组CDP+F)、单纯肿瘤组(CA)及肿瘤抑郁组(无药物干预抑郁荷瘤组CD)、正常对照组(CON)。肿瘤接种后给予小鼠慢性不可预见性应激刺激,观察各组小鼠状态,定期测量小鼠体重变化,测量各肿瘤组小鼠肿瘤生长情况。接种6周后,对各组小鼠进行抑郁行为学评价;分离肿瘤组织并称重,比较各肿瘤组小鼠肿瘤重量差异,计算抑瘤率以评价干预效果;通过流式细胞术检测小鼠血液CD3/CD8、CD3/CD4、Th22细胞含量比例;通过ELISA法检测各组小鼠外周血IL-22水平;WESTERN BLOT法检测肿瘤组织IL-22、P38、p-p38、ERK、P-ERK、c-JNK及p-JNK含量。研究结果:1.实验后小鼠体重、糖偏好及强迫游泳不动时间比较:实验后各组小鼠体重差异显著(F=24.784,P<0.001)。其中,抑郁组小鼠体重小于对照组和肿瘤组小鼠;肿瘤抑郁组小鼠体重小于肿瘤组小鼠,说明慢性应激使荷瘤及无肿瘤抑郁组小鼠体重下降。各组小鼠实验后糖偏好值(%)差异显著(F=15.798,p<0.001)。其中,抑郁组小鼠的糖偏好百分比低于对照组,肿瘤抑郁组小鼠低于对照组和肿瘤组,说明使用慢性应激刺激建立的小鼠抑郁模型实验动物出现兴趣减退。肿瘤抑郁组小鼠的糖偏好百分比小于肿瘤抑郁抗抑郁组及肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组,肿瘤抑郁化疗组小鼠的糖偏好百分比与肿瘤抑郁组无显著差异。可见,帕罗西汀抗抑郁治疗能够逆转慢性应激造成的小鼠对蔗糖水偏好的变化,氟尿嘧啶化疗对实验动物糖偏好无影响。各组小鼠强迫游泳不动时间差异显著(F=4.861,p<0.001)。其中,抑郁组小鼠的强迫游泳不动时间大于对照组;肿瘤抑郁组小鼠的不动时间大于肿瘤组;肿瘤抑郁抗抑郁组及肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组小鼠的不动时间少于肿瘤抑郁组,可见,慢性不可预见性应激使抑郁组和肿瘤抑郁组小鼠强迫游泳的不动时间均延长,帕罗西汀治疗能够逆转慢性应激造成的变化,氟尿嘧啶化疗对强迫游泳不动时间无影响。2.实验动物肿瘤生长情况:(1)各肿瘤组小鼠肿瘤体积:接种后第35天(第五周)后,各肿瘤组小鼠肿瘤体积差异显著,肿瘤抑郁组小鼠肿瘤体积最大,肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组肿瘤体积最小。可见,肿瘤伴抑郁小鼠的肿瘤体积增大更明显,说明抑郁障碍对肿瘤生长有促进作用;氟尿嘧啶化疗可抑制肿瘤生长,减小肿瘤体积,化疗与帕罗西汀抗抑郁联合治疗效果更明显。(2)各肿瘤组小鼠肿瘤动态生长曲线显示,至接种后23天左右,肿瘤开始迅速生长,其中肿瘤抑郁组肿瘤生长最快,至接种后第五周,肿瘤体积最大。说明长期慢性刺激导致的抑郁障碍可加速肿瘤小鼠的肿瘤生长。(3)各肿瘤组小鼠瘤重测量及抑瘤率:各组荷瘤小鼠瘤重不完全相等(F=12.920;p<0.001),肿瘤抑郁组小鼠瘤重最大,肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组瘤重最小,肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组抑瘤率百分比最高。3.各组小鼠血液CD4/CD8检测结果各组小鼠血液CD4/CD8比例差异显著(F=7.156,p<0.01)。肿瘤抑郁组小鼠CD4/CD8低于正常对照组和肿瘤组。可见,荷瘤小鼠慢性应激抑郁可使小鼠血液CD4/CD8比例降低。肿瘤组小鼠CD4/CD8低于正常对照组;肿瘤抑郁组小鼠CD4/CD8低于抑郁组小鼠。可见,结直肠癌肿瘤小鼠血液CD4/CD8比例降低。肿瘤抑郁组小鼠CD4/CD8低于肿瘤抑郁化疗组和肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组小鼠。可见,氟尿嘧啶化疗及帕罗西汀抗抑郁+氟尿嘧啶化疗联合治疗CD4/CD8比例升高。4.流式细胞术检测小鼠外周血Th-22结果:各组小鼠血液Th22细胞/CD4+T细胞的比例差异显著(F=19.904,p<0.001)。肿瘤抑郁组小鼠血液Th-22细胞含量高于肿瘤组小鼠;肿瘤组小鼠Th-22细胞含量高于正常对照组小鼠。说明,慢性应激抑郁可使结直肠癌小鼠血清Th-22细胞含量增加,结直肠癌也可使小鼠血清Th-22细胞含量升高。各治疗组TH-22结果显示,肿瘤抑郁抗抑郁组、肿瘤抑郁化疗组和肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组小鼠Th-22细胞含量低于肿瘤抑郁组小鼠。说明帕罗西汀抗抑郁和氟尿嘧啶化疗可明显降低血清Th-22细胞含量。5.ELISA法检测血清IL-22水平结果:各组小鼠血清IL-22水平不完全相同(F=9.793,p<0.001)。抑郁组和肿瘤抑郁组小鼠IL-22水平高于正常对照组,说明慢性应激抑郁使小鼠血清IL-22水平升高。肿瘤组小鼠IL-22水平高于正常对照组小鼠;肿瘤抑郁组小鼠IL-22水平高于抑郁组小鼠。说明结直肠癌肿瘤小鼠血清IL-22水平升高。肿瘤抑郁组小鼠血清IL-22水平高于肿瘤抑郁抗抑郁组、肿瘤抑郁化疗组和肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组小鼠,说明帕罗西汀抗抑郁治疗、氟尿嘧啶化疗和抗抑郁+化疗联合治疗均可降低血清IL-22水平。6.Western Blotting方法检测肿瘤组织IL-22蛋白结果:各肿瘤组小鼠肿瘤组织IL-22含量差异显著(F=11.248,p<0.001)。肿瘤抑郁组小鼠肿瘤组织中IL-22水平高于肿瘤组小鼠,说明慢性应激抑郁可以使小鼠肿瘤组织中IL-22水平升高。肿瘤抑郁组小鼠肿瘤组织中IL-22水平高于肿瘤抑郁抗抑郁组、肿瘤抑郁化疗组和肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组小鼠。说明帕罗西汀抗抑郁治疗、氟尿嘧啶化疗和抗抑郁+化疗联合治疗均可以使小鼠肿瘤组织中IL-22水平下降。7.Western Blotting法检测肿瘤组织p-p38、p-ERK、p-JNK结果:各肿瘤组小鼠p-p38、p-ERK、p-JNK表达差异显著(F=9.416,F=7.952,F=7.311,p<0.01)。肿瘤抑郁组小鼠p-p38、p-ERK、p-JNK水平高于肿瘤组小鼠,说明慢性应激抑郁可以使小鼠肿瘤组织中p-p38、p-ERK、p-JNK水平升高。肿瘤抑郁组小鼠肿瘤组织中p-p38、p-EPK、p-JNK水平高于肿瘤抑郁抗抑郁组、肿瘤抑郁化疗组和肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组小鼠;肿瘤抑郁抗抑郁+化疗组小鼠肿瘤组织中p-p38、p-EPK、p-JNK水平低于肿瘤抑郁组抗抑郁组和肿瘤抑郁化疗组小鼠。可见,肿瘤和抑郁小鼠的P-p38、P-erk和P-jnk蛋白水平显著升高,表明MAPK信号通路被激活。抗抑郁治疗、化疗和抗抑郁+化疗联合治疗降低了P-p38、P-erk和P-jnk,抗抑郁+化疗联合治疗后各指标降低最显著,说明MAPK信号通路受到明显抑制。结论:慢性不可预见性应激能导致肿瘤小鼠的抑郁样行为;结直肠癌小鼠合并抑郁促进肿瘤生长,氟尿嘧啶化疗联合帕罗西汀抗抑郁治疗可有效抑制肿瘤生长;结直肠癌伴抑郁小鼠CD4/CD8比值下降;Th-22细胞在结直肠癌伴抑郁小鼠的体内含量增高,IL-22在结直肠癌伴抑郁小鼠的体内及肿瘤组织内含量均增高;氟尿嘧啶化疗和帕罗西汀抗抑郁治疗可有效降低血液Th-22细胞及血液和肿瘤组织中IL-22的水平,两种药物联合使用效果更佳。帕罗西汀联合氟尿嘧啶能通过抑制细胞因子IL-22的表达,调节MAPK信号通路的激活抑制结直肠癌伴抑郁小鼠肿瘤细胞的生长。