菘蓝木脂素糖基转移酶UGT71B5的功能研究

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木脂素类化合物是菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的主要抗病毒活性成分之一。目前菘蓝中发现的木脂素类化合物包括以下四类:双四氢呋喃类(松脂醇,pinoresinol,pin)、四氢呋喃类(落叶松脂素,lariciresinol,lar)、二芳基丁烷类(开环异落叶松脂素,secoisolariciresinol,sec)、二芳基丁内酯类(罗汉松脂素,matairesinol,mat)及其糖苷衍生物。现代药理研究表明糖苷基团是木脂素类化合物抗病毒活性的重要结构,并且不同形式的糖苷化也会导致其抗病毒活性的差异,而在植物体中木脂素糖苷化的过程是由糖基转移酶(uridine diphosphatedependent glycosyltransferases,UGT)催化完成的,但是在菘蓝中催化木脂素糖苷化的糖基转移酶尚未有报道。首先,本研究借助菘蓝全基因组注释获得菘蓝UGT基因序列,构建UGT蛋白家族同源进化树,通过和已知功能的UGT进行同源比对,筛选出与AtUGT72B1(具有催化木脂素前体—单木质酚糖苷化的活性)亲缘最近的两条基因序列IiUGT71B5-1和IiUGT71B5-2。后续通过体外酶活实验和UHPLC-QTOF/MS检测目标产物对UGT进行功能验证,结果表明UGT71B5-1具有催化松脂醇、落叶松脂素单糖苷化,同时可催化松脂醇双糖苷生成;而UGT71B5-2仅催化松脂醇生成单糖苷,且催化活性较低。其次,利用LC-MS对菘蓝不同器官(根、叶)和根不同组织(表皮和皮层、韧皮部、木质部和形成层)中木脂素类化合物的空间分布进行表征,发现菘蓝中至少含有4种木脂素和4种木脂素糖苷,且大多数木脂素以糖苷的形式存在。其中松脂醇、松脂醇单糖苷和罗汉松脂素单糖苷主要分布在根中,且表皮和皮层中含量最高;而落叶松脂素、开环异落叶松脂素及其单糖苷在叶中的分布远高于根中。然后,理化特性研究显示UGT71B5-1在pH 8.0、30℃时活性最高,且属于非金属阳离子依赖性蛋白酶。接着,又进一步考察了UGT71B5-1的催化特征,发现UGT71B5-1具有底物催化的广泛选择性和糖供体的杂泛性,并确定了双四氢呋喃类木脂素(如松脂醇)是重组蛋白UGT71B5-1体外催化的最适底物结构。最后,通过UGT71B5-1的转录特征研究,发现UGT71B5-1在根和叶中均有表达,其中叶中表达量远高于根中;而在根的不同组织中,表皮和皮层转录水平最高,在木质部和形成层、韧皮部中转录水平较低且无显著差异。同时,利用融合荧光蛋白进行亚细胞定位显示UGT71B5-1在细胞质中表达,这和大部分报道的UGT相一致。此外UGT71B5-2的催化特征和表达特征与UGT71B5-1相似,但催化活性远低于UGT71B5-1,并且基因的相对表达量同样较低。综上,本研究考察了两条具有松脂醇糖苷化活性的UGT,并较为全面地解析了酶的催化特性和基因的表达特征,为后续UGT的筛选提供参考,也为开展木脂素苷类活性成分的代谢工程提供了催化元件。
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