目的：胃肠间质瘤(Gastrointestinal stromal tumors, GISTs)是目前所知的最常见的胃肠道间叶源性肿瘤,肿瘤起源于胃肠道Cajal间质细胞(ICCs),这种细胞作为胃肠道起搏细胞,与整个胃肠道的蠕动功能相关,同时它还具有干细胞特征。免疫表型CD117呈阳性表达及遗传学上频发c-KIT基因或PDGFRA(血小板衍生生长因子α)基因突变是胃肠间质瘤最重要的生物学特征。免疫组织化学检测显示仍有5-10%的GISTs免疫组化CD117呈阴性表达,而对这类患者的诊断,近年来的研究热点集中于寻找新的特异性诊断指标,其中DOG1(Discovered on GISTs-1)的敏感性与CD117相似,而特异性与CD117相似甚至更高,对于CD117表达阴性而组织形态学符合GISTs的病例,指南指出若DOG1免疫组化检测呈阳性表达则可作出GISTs诊断。随着对GISTs研究的不断深入,以小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)为代表的分子靶向治疗已经成为复发转移性GISTs的一线治疗方案,TKIs与外科手术相配合,使基于肿瘤分子分型的GISTs个体化治疗进入了新时代,尤其是那些具有对TKIs治疗高敏感性的突变类型的GISTs患者。但研究表明临床上仍有5-10%的GISTs患者缺乏c-KIT基因或PDGFRA基因突变即野生型GISTs,且不同基因突变型别的GISTs患者对TKIs的敏感性不同,同时GISTs本身的生物学特性也决定了GISTs容易发生转移和复发,因此确定患者是否存在突变及存在何种类型的突变对GISTs个体化治疗方案的制定有着很重要的指导价值。而野生型GISTs一般没有应用TKIs治疗的指征,对这类患者而言,预后往往较差。近年来在对GISTs的基因分析中发现了一些新的突变,如在野生型GISTs中检测出BRAF基因"V600E"突变,另外PIK3CA基因外显子20的突变也出现在一些GISTs患者中,在其他的恶性肿瘤中的研究中报道过这些突变,它们与肿瘤的恶性生物学行为之间存在联系。另外,近年来在野生型GISTs中还发现了IGF1R(类胰岛素生长因子受体-1)的表达,在这类患者中有些出现了IGF1R编码基因的扩增,但未检测出基因突变的存在。临床上关于GISTs基因突变状况与临床病理特征(包括患者年龄、性别、肿瘤原发部位、肿瘤大小、肿瘤危险度分级等)、免疫组化表达之间的联系国内外研究尚无统一定论,可能与人种差别有关。本研究通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)检测77例GISTs患者中c-KIT、PDGFA、BRAF、 KRAS、PIK3CA基因突变情况,总结本组GISTs基因突变状况,分析其与GISTs患者临床病理特征及DOG1、CD117、IGF1R免疫组化表达情况之间的关系,统计学分析采用SPSS20.0软件对数据进行统计学处理,计数资料以率表示,组间比较采用χ2检验,四格表资料若出现n<40或理论频数T<1或实际频数为0时需采用Fisher确切概率法,当n≥40但有1≤T<5时需连续性校正,列联表资料若出现T<1和／或出现1≤T<5的格子超过格子总数的1/5不满足卡方检验的适用范围时采用列联表确切概率法,以P<0.05为有统计学差异。方法收集2001-2010年南方医院临床资料完整的GISTs患者77例,在已有的免疫组化检测结果上加入对DOG1、IGF1R的检测。经脱蜡、沉淀、洗脱等步骤提取标本DNA后,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)检测每例样本c-KIT、PDGFRA、BARF、KRAS、PIK3CA基因突变情况。根据患者的临床病理特征、免疫组化情况进行分组,采用χ2检验的统计学方法分析患者基因突变状况与临床病理特征及DOG1、CD117、IGF1R免疫组化表达情况的关系。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)是一种新型的应用于大分子生物活性物质检测分析的分子生物学技术,在检测基因突变方面,与传统的直接测序法相比,具有准确性高、精确性、试验周期短等优点,其局限性在于仅能对已经确证存在的基因突变位点进行针对性检测,而无法检测未知突变。统计学分析采用SPSS20.0软件对数据进行统计学处理,计数资料以率表示,组间比较采用χ2检验,四格表资料若出现n<40或理论频数T<1或实际频数为0时需采用Fisher确切概率法,当n≥40但有1≤T<5时需连续性校正,列联表资料若出现T<1和/或出现1≤T<5的格子超过格子总数的1/5不满足卡方检验的适用范围时采用列联表确切概率法,以P<0.05为有统计学差异。结果77例GISTs患者中,c-KIT基因总突变率为64.94%(50/77),其中：外显子11突变的有27例(54.00%,27/50；35.06%,27/77),分别为：delW557K55814例,L576P9例,delV5594例；外显子9突变16例(32.00%,16/50；20.78%,16/77),均为A502Y503insAY;外显子13突变4例(8.00%,4/50；5.19%,4/77),均为K642E;外显子17突变3例(6.00%,3/50；3.90%,3/77),均为D820Y。PDGFRA基因总的突变率为22.08%(17/77),检出外显子18D842V突变4例(23.53%,4/17；5.19%,4/77)及外显子12V561D13例(76.47%,13/17；16.88%,13/77)。10例野生型GISTs包括6例IGF1R免疫组化阳性表达的病例,其中有2例出现BRAF基因外显子15"V600E"的突变。统计学分析显示：1、c-KIT、PDGFRA基因突变情况在不同性别、年龄、肿瘤大小、核分裂像、组织学类型以及危险度组间的差异无统计学意义(P值均>0.05),不同发生部位的GISTs组间c-KIT、PDGFRA基因突变情况的差异有统计学意义(x2=14.341,13.341,P=0.001,0.002)；2、c-KIT、PDGFRA基因突变组与无突变组间DOG1、CD117免疫组化表达的差异无统计学意义(χ2=0.524,P=0.469；χ2=0.306,P=0.580；χ2＝0,p=1.000；Fisher确切概率法计算P=0.121,P值均>0.05),而c-KIT基因突变组与无突变组间IGF1R免疫组化表达的差异有统计学意义(χ2=9.156,P值=0.002),c-KIT基因或PDGFRA基因不同突变位置组间的DOG1、CD117免疫组化表达的差异无统计学意义(c-KIT:χ2＝1.709,3.921,P=1.000,0.460；PDGFRA:Fisher确切概率法P=0.235,1.000)；3、IGF1R在野生型GISTs的免疫组化表达阳性率高于突变型GISTs(60.00%VS0.00%),野生型及突变型GISTs组间IGF1R免疫组化表达的差异有统计学意义(P<0.001)。77例标本中,3例CD117免疫组化呈阴性表达的GISTs,其中1例出现c-KIT基因外显子9"A502Y503insAY"突变,2例有PDGFRA基因外显子12"V561D”突变；5例DOG1呈阴性表达的病例,2例有c-KIT基因突变,分别为外显子9"A502Y503insAY"突变外显子11"L576P"突变,1例有PDGFRA基因外显子18"D842V"突变,2例为野生型；10例野生型GISTs中有8例免疫组化CD117及DOG1均呈阳性表达。结论对77例GISTs患者基因突变状况与临床病理特征、免疫组化结果的统计学分析显示,c-KIT基因或PDGFRA基因是否突变、突变类型仅与肿瘤原发部位相关,而野生型GISTs与突变型GISTs在IGF1R的表达上的差异具有统计学意义(P<0.001)。不同基因突变类型与肿瘤生物学行为之间存在联系,本组GISTs病例中出现PDGFRA基因突变的患者,其基因突变类型和临床病理特征与国外报道存在差异,而与国内的一些研究具有一致性的结果,本组GISTs中出现PDGFRA基因突变的患者多为高危患者,这点与国内的一些报道一致,而国外研究中出现PDGFRA基因突变的GISTs患者临床经过上多呈“良性”,这表示基因突变在不同人种中存在差异,而在基因突变类型上,我们的研究中PDGFRA基因外显子12"V561D”的突变率高于18外显子“D842V"。GISTs中IGF1R免疫组化检测可以作为一个筛查手段,单独或联合其他的免疫组化指标,在进行基因突变检测分析前对患者进行初步筛选,从而更有针对性地进行突变检测。IGF1R在野生型GISTs中高表达这一特性使它有可能成为GISTs潜在的治疗靶点,其抑制剂可以作为野生型GISTs患者的特异靶向治疗药物,从而改善野生型GISTs的预后。除了目前已经非常明确的c-KIT基因、PDGFRA基因突变之外,本组GISTs中有两例野生型GISTs患者存在BRAF基因外显子15的“V600E”突变,这两例患者在临床特征上与已有报道相似。BRAF基因的这种突变在其他恶性肿瘤中具有促进肿瘤细胞生长、增强肿瘤细胞抗凋亡能力、促进肿瘤细胞迁移等作用,与恶性生物学行为密切相关,而在GISTs中观察到BRAF基因外显子15“V600E”突变与c-KIT基因或PDGFRA基因突变是相互独立的存在,目前在恶性黑色素瘤、肾癌中分别在进行BRAF抑制剂的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验,可能对GISTs也有一定的效果,这些亟需大样本临床研究进一步确证。本组GISTs中未检测出PIK3CA基因突变,但已有研究报道GISTs中存在PIK3CA基因突变。PIK3CA基因已被证实是一种癌基因,且是发生体细胞突变的唯一基因,其编码产物PI3Ks参与重要的分子信号传导通路——磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt),该通路是调节细胞功能的重要途径,在细胞信号网络中处于很重要的地位,与细胞的增殖、粘附、分化,细胞支架结构的重排和胞内运输等相关。研究显示PIK3CA的突变约4/5发生在螺旋区(外显子9)和激酶区(外显子20)这两个热点区域,通过不同的机制引起酶功能性的改变。PIK3CA基因突变在乳腺癌、卵巢癌、骨髓异常增生综合症、非小细胞肺癌、结肠癌等肿瘤中均有相关报道,且在这些肿瘤中PIK3CA基因的突变往往与肿瘤进展、侵袭等恶性生物学行为相关,在有些恶性肿瘤中其突变与否甚至是预后不良的一个独立的危险因素。可见,PIK3CA的突变不仅与恶性肿瘤的发生发展有关,与肿瘤的分期、分级及预后也有密切关系。目前在GISTs中曾报道过PIK3CA基因外显子20“H1047L”突变,它与c-KIT基因外显子11"K558E562del"突变同时发生。对本组GISTs患者研究中虽未发现存在PIK3CA基因突变的GISTs病例,但研究PIK3CA基因突变与GISTs的临床、病理特征的相关性对于临床早期诊断GISTs及判断预后可能存在重要意义。虽然对GISTs患者c-KIT基因及PDGFRA基因的研究已经相当成熟,在特异性分子靶向治疗药物的研制方面也取得了很大的进步,这些成果都对GISTs患者诊断、分期、个体化治疗方案的制定、预后判断有很大意义。但对于GISTs对TKIs原发耐药及继发耐药的机制尚不完全清楚。GISTs最初的某些基因突变类型可能导致了原发耐药,而由于GISTs本身具有非定向分化的生物学特性,其生物学行为难于预测,在治疗过程中可能出现分子型别的改变从而导致原本有效的TKIs分子靶向治疗失败,即出现继发耐药,这些可能与新突变的出现相关,继续探索GISTs分子分型将有助于更好地对患者进行个体化治疗并帮助患者克服在传统TKIs治疗中出现的耐药,提高疗效,改善GISTs患者的生存及预后。