研究背景肾脏移植是终末期肾病的最佳治疗手段。虽然随着移植手术技巧的改进,组织配型、器官保存技术的提高,新型免疫抑制药物的应用,围手术期并发症及早期急性排斥反应发生率明显降低,大大增加了移植物一年的存活率,然而移植物的半寿期仍徘徊在11～12年。在过去的二十多年里,尸体肾移植的1年存活率已经普遍超过80%,而亲属供肾存活率则达到90%～95%水平。这些成就归功于我们对移植免疫学理解的加深和良好的组织配型、器官保存及普乐可复、环孢素等更强、更具选择性的免疫抑制剂的应用。虽然普乐可复、环孢素的应用明显减少了急性排斥反应的发生率及严重程度,然而在过去二十多年里的应用证明它们对于治疗移植肾慢性功能衰竭并没有多大效果,而且移植肾的半数存活率也没有明显提高。近50%的移植肾在移植后十年左右即出现移植肾功能衰竭而要重新进行血透或进行再移植治疗。目前有研究数据表明,尽管移植肾1年存活率普遍可以达到90%以上的水平,但通常每年仍然有4%～5%移植肾逐渐丧失,导致移植肾5年存活率大概为70%,10年存活率仅为50%左右。引起远期移植肾功能衰竭的最常见原因是慢性移植肾肾病,现在定义为无明确病因的移植肾间质纤维化和小管萎缩,它所引起的移植肾功能衰竭占肾移植1年后因为各种原因发生移植肾功能衰竭构成比的50%～80%。慢性移植肾肾病最主要的特征就是移植肾纤维化。肾间质纤维化是由各种细胞、细胞因子、炎症因子、炎症介质等诸多因素相互作用,导致细胞外基质（ECM）代谢失衡,在间质异常积聚所致,是一个非常复杂的过程,至今,移植肾纤维化发生、进展的关键环节和确切发病机制并未完全阐明。进一步研究慢性移植。肾纤维化的发病机制,能为寻求有效阻断CAN病变发生发展的治疗措施提供理论依据,为临床CAN的治疗及移植肾的长期存活带来曙光。目的1、研究慢性移植肾肾病（CAN）组织病理学特点。2、探讨整合素连接激酶（integrin-linked kinase,ILK）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、E-钙蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅳ型胶原蛋白（CollagenⅣ）在移植肾组织中表达的变化及其意义。3、探讨ILK在CAN患者移植肾纤维化中的作用及机制,进一步阐明移植肾慢性纤维化的分子病理机制,为临床治疗CAN提供相应的理论及思路。方法收集30例经移植肾穿刺活检病理确诊为无明确病因的肾间质纤维化和小管萎缩的移植肾活检标本。患者为同种异体肾移植术后1～15年出现移植肾功能减退者,平均肾移植时间为（4.5±3.2）年,其中男22例,女8例,年龄21～59岁,平均（42.4±9.0）岁。25例接受CsA+MMF+Pred三联免疫抑制治疗方案,5例接受FK506+MMF+Pred方案治疗。供、受者血型相同,淋巴细胞毒交叉配型试验（CDC）＜10%,群体反应性抗体（PRA）＜10%,HLA之A、B、Dr位点至少有2个位点相配。另以10例正常肾组织作为对照组（正常组）,均为正常供体尸肾术前穿刺活检标本,病理检查无异常,均为男性,年龄25～50岁,平均（34.8±9.6）岁。40例肾组织标本均制成蜡块,同时进行HE染色,PASM染色和Masson三色染色,同时行IgG、IgA、IgM、Clq和C4c免疫组化检测,光镜下观察移植肾病理改变。对移植肾组织标本按照“Banff’2007”移植肾病理分类标准进行病理诊断及分级,将病理诊断为无任何特殊病因的间质纤维化和小管萎缩（IF/TA）分为:Ⅰ级轻度间质纤维化和肾小管萎缩（＜25%的皮质受累）;Ⅱ级中度间质纤维化和肾小管萎缩（26%～50%的皮质受累）;Ⅲ级重度间质纤维化和肾小管萎缩或丧失（＞50%的皮质受累）,可以包括非特异的血管和肾小球硬化但以小管间质病变严重性分级。所有标本均采用免疫组织化学ELiVision^TM plus二步法检测肾组织中TGF-β1、ILK、E-cadherin、α-SMA、CollagenⅣ的表达。图像分析方法采用Leica Qwin高清晰度彩色病理图像分析系统（型号DMR+Q550）,通过光学显微镜放大400倍摄取并分析图像。每例标本连续选取10个不重叠（避开肾小球和大血管）的肾小管间质高倍视野（×400,HPF）,观察部位包括肾皮质、皮髓交接处和髓质部的肾小管间质,每例肾小管总数＞60个。对所选视野中的阳性信号进行图像分析,用半定量法估计各因子的表达情况。在免疫组化标本中,计算每个视野中肾小管和肾间质阳性着色的面积与视野内肾小管间质总面积（去除肾小管管腔）的比值,计算其均值代表此例患者某种成分在肾小管和间质的相对含量。统计学处理方法采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,ILK、TGFβ1l、E-cadherin、α-SMA和Ⅳ型胶原的表达量进行方差齐性检验（Levene检验）后,方差齐者采用单因方差分析（one-way ANOVA）比较各指标的组间差异,并采用LSD法进行两组间的多重比较;方差不齐者则采用F检验Welch法进行比较,并采用Dunnett’T3法进行两组间的多重比较,双变量相关性采用Pearson相关或（Spearman相关系数）等级相关分析,取双侧,检验水准α=0.05,P＜0.05被认为差异有统计学意义。结果1、慢性移植肾肾病患者移植肾组织学改变主要表现肾间质弥漫性纤维化,伴有淋巴细胞、浆细胞、单核细胞浸润;肾小管不同程度萎缩,排列较紊乱,基底膜增厚,部分髓质集合管代偿性扩张,蛋白管型常见;肾小球系膜基质及系膜细胞增生,基底膜增厚,肾小球毛细血管丛节段性硬化甚至肾小球完全玻璃样变,部分病例细小动脉内膜向心性纤维性增殖,管腔狭窄或闭塞。2、肾小管间质ILK、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA和Ⅳ型胶原的表达变化免疫组织化学染色显示:在正常肾脏组织,ILK无或仅有极少量表达;TGF-β1主要表达于肾小管上皮细胞胞浆中,多呈弱阳性表达;E-cadherin在小球和小管的上皮细胞胞膜上有大量表达,胞浆中有少量表达;α-SMA仅表达于血管平滑肌肌层,在肾间质偶有表达,小管上皮细胞无表达;Ⅳ型胶原主要分布在肾小球、肾小管基底膜、肾小球包曼氏囊壁和系膜区,肾间质中少量散在分布,肾小管上皮细胞中未见表达。而在慢性移植肾肾病患者移植肾组织中,ILK主要表达于肾小管上皮细胞和间质细胞胞浆中,表达水平较正常肾组织明显增强,随着间质病变程度的加重,ILK表达显著增加,分布于从近端小管到髓质集合管上皮细胞胞浆,萎缩变性的肾小管表达最为强烈,一些发生变性、坏死、脱落到管腔的小管上皮细胞也可以见到ILK阳性颗粒,肾间质细胞中亦可见到ILK表达,间质病变越重,表达量越多,范围越广;TGF-β1在小管上皮细胞、间质成纤维细胞胞浆中及间质基质区多呈强阳性表达,部分肾小球包曼氏囊壁亦有表达,偶见于间质小血管周围和血管内皮细胞中;α-SMA除表达于血管平滑肌肌层外,广泛分布于间质区域,一些管腔破坏和萎缩的肾小管上皮细胞胞浆也可见表达;E-cadherin在肾小管的上皮细胞胞膜上的表达较正常肾组织显著减少,小管间质损害越重,表达量越少;Ⅳ型胶原除在肾小球和肾小管基底膜、肾小球包曼氏囊壁和系膜区的表达较正常肾组织有不同程度增加外,在肾间质中表达亦显著增加,而且在小血管周围和管壁中也有表达,肾小管上皮细胞中则无表达。3、统计学分析结果显示,ILK、TGF-β1、α-SMA和Ⅳ型胶原在移植组肾小管、间质的表达比正常肾组织显著增多,两者间差异均有显著性（P值均＜0.001）,ILK、TGF-β1、α-SMA和Ⅳ型胶原的表达随移植肾IF/TA的病理分级的加重而呈增加的趋势,但α-SMA在移植肾IF/TAⅡ级和Ⅲ级组间表达量差异不显著（P＞0.05）。E-cadherin的表达在移植组肾小管、间质的表达比正常肾组织显著减少（P＜0.001）,并随移植肾IF/TA的病理分级的加重而呈减弱的趋势。经等级相关分析,ILK、TGF-β1、α-SMA和Ⅳ型胶原表达水平均与移植肾IF/TA的病理分级程度呈正相关,（r分别为0.802、0.939、0.858和0.887,P＜0.001）,而E-cadherin的表达水平与移植肾组织小管间质病变程度呈负相关（r=-0.868,P＜0.001）。在CAN患者移植肾组织中,ILK与TGF-β1、α-SMA和CollagenⅣ的表达量均呈正相关（r=0.815,r=0.700,r=0.727,P＜0.001）,与E-cadherin表达量呈负相关（r=-0.618,P＜0.001）,ILK与CAN患者的SCr之间呈正相关（r=0.662,P＜0.001）。TGF-β1与α-SMA、CollagenⅣ在移植肾小管间质中的表达量均呈正相关（r=0.805,r=0.870,P＜0.001）,而与E-cadherin表达量呈负相关（r=0.779,P＜0.001）。结论1、慢性移植肾肾病患者移植肾组织学改变主要表现为肾间质纤维化、小管萎缩,肾小球硬化、血管内膜增生和单个核细胞浸润。2、CAN患者移植肾小管间质中ILK呈高表达,其表达水平随移植肾IF/TA的病理分级的加重有增加的趋势,与CAN患者SCr上升呈正相关,提示ILK的增加与移植肾病理改变的发生机制有关,并与CAN患者的移植肾功能减退有关。3、CAN患者移植肾小管间质中Ⅳ型胶原表达水平较正常对照显著增加,并有随移植肾IF/TA的病理分级增加而增多的趋势,说明Ⅳ型胶原的异常沉积是CAN患者移植肾纤维化的重要表现。4、正常对照肾组织中的小管上皮细胞的胞膜上有大量的上皮细胞标志物E-cadherin的表达,无肌成纤维细胞的标志蛋白α-SMA的表达,而在CAN患者移植肾坏死和萎缩的肾小管上皮细胞胞膜上的E-钙蛋白表达量明显减少,且E-钙粘蛋白的表达水平有随移植肾IF/TA的病理分级增加而呈逐渐减弱的趋势,并出现了肌成纤维细胞的标志物α-SMA,后者广泛分布于间质区域,一些管腔破坏和萎缩的肾小管上皮细胞胞浆也可见表达。这些结果提示EMT可能参与了CAN患者移植肾纤维化的发生、发展。5、在移植肾组织中,TGF-β1呈高表达,其表达水平有随IF/TA的病理分级的增加而增多的趋势,同时与Ⅳ型胶原及肌成纤维细胞的标志性蛋白（α-SMA）表达水平呈正相关,而与E-钙粘蛋白的表达呈负相关性,提示TGF-β1的上调可能诱导移植肾小管发生EMT而参与移植肾的纤维化形成。6、CAN患者移植肾组织中,ILK的表达与TGF-β1、α-SMA和CollagenⅣ的表达均呈正相关,而与E-cadherin的表达水平呈负相关。这些结果提示,ILK可能参与了TGF-β1诱导移植肾小管EMT过程,最终导致移植肾纤维化,在慢性移植肾纤维化进程中发挥了重要作用。