神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是研究最深入的神经营养因子之一，已证明其能促进神经元增生和分化，调节中枢和外周神经元存活和轴突生长；在视网膜病理状态下不仅能保护神经元、减少视细胞凋亡的发生，而且还能增强视细胞抵抗病理环境的适应能力，但NGF眼局部应用研究如结膜下注射和玻璃体内注射都有难以克服的缺点，极大地限制了NGF的临床应用，临床上急需新的NGF合理恰当的给药方法和制剂。 目的：本研究将rm2.5s-β NGF包裹到天然可降解材料胶原蛋白中，做成缓释药膜，植入实验动物眼内，评价NGF能否从缓释药膜中释放出来，能否经巩膜跨艰球壁进入眼内组织；了解其在玻璃体内蓄积、分布、消除的药代动力学。为进一步将NGF应用于临床提供理论和实验依据。 方法：本实验分两部分实施： A．单向NGF胶原缓释药膜的制作： 称取新鲜牛肌腱组织20g，剥掉外筋膜，将肌腱组织切碎后，用0.05％洗必泰充分洗涤消毒杀菌5min，用三蒸水冲洗8次，放入捣碎机中反复捣碎，然后放入滤纱上洗涤脱脂。称取66mg胃蛋白酶(pepsin)加入新配制的0.1M稀盐酸100ml中溶解，再加入捣碎的肌腱组织，然后加水至1000ml搅拌均匀，30℃恒温培养72h，中间每5h搅拌1次。将经胃蛋白酶消化后的肌腱组织倒入离心管(eppendorf)中，对称放入离心机，7000rpm离心15h，设定温度为4℃。取离心后的eppendorf管上清液即透明的胶原蛋白溶胶，弃去残渣，用4M的NaoH调整PH值到10-11，终止胃蛋白酶的反应，放置40℃冰箱过夜。然后将胶原蛋白溶胶加入到NacL过饱和郑州大学2004届硕士研究生毕业论文神经生长因子巩膜外定向缓释给药的研究溶液中盐析2次除去可溶性杂质，再将盐析后的胶原组织通过漏斗装入透析袋，将透析袋放入5000nl】三蒸水中透析4d，用0.IM硝酸银检验透析溶液的氯离子含量直到没有白色沉淀为止。从透析袋中取出胶原组织加入NGF粉针剂5.4mg混匀，然后加入2%醋酸18m儿再加入无菌三蒸水360ml，使醋酸终浓度为1编，放置Zh.将混合物倒入模具中，放入冻千机中72h冻干成形。取240mg高分子聚乳酸PLA (152KD)溶于 12而氯仿中，待其完全溶解后将此溶液倒在消毒后的玻璃槽中等待约20mln，待氧仿将近挥发完，PLA成膜时将冻千的NGf一胶原药膜从模具中取出，放于PLA膜上待其完全凉干后，将PLA-NGF一胶原药膜从玻璃板上取下二再将单向处理过的药膜按相同尺寸制成4nun义10n胜n大小的54个NGF一胶原缓释药膜放置在4℃冰箱中备用。B:巩膜外植入单向.G「一胶原缓释药膜测定玻璃体内的药代动力学 1.利用BAS.EUSA法测定NGF标准曲线、回收率、精密度。 2.选用成年健康白兔60只，体重2.5一skg，雌雄兼用。随机分成10组，每组6只，随机取出一组作为对照组，该组家兔双眼随机取一只眼作为实验对象，各实验对象巩膜外不植入NGF缓释药膜，其余各组为实验组，实验组白兔双眼随机取一只眼作为实验对象，各实验对象结膜下巩膜t外植入NGf.胶原缓释药膜，植入的位置相同都在下直肌的下面。分别于植入NG田缓释药膜后第2d、3d、6d、3d、gd、11d、12d、15d、18d各处死一组白兔，立即取玻璃体样品，用BAS一ELISA法测玻璃体内NC万的浓度。玻璃体内药物浓度一时间数据符合二房室开放模型，用3P97药动学程序，计算主要药动学参数。结果: 1 .NGF标准曲线线性范围在15.625一1伽味叼而线形关系良好，标准曲线方程为Y=0.以均9848X+0.04822，r==o.9583，n二4，P<0.001，最小检测浓度为15.625四m!。平均回收率为98.85月.72%;日内差与日间差扭sD)均小于10%，证明该研究方法符合生物样品的分析要求。 2.正常对照组白兔的玻璃体浓度约为55.83玛2.80 Pg/Inl。实验组NGF缓释药膜植入术后药物浓度于第3d达到峰浓度(20.91呵m】)，第18d降至正常。NGF在玻璃体内的消除半衰期约7.41d。药一时曲线下面积AUCO二，为232，78801(ng/刘)d:结论:郑州大学2004届硕士研究生毕业论文神经生长因子巩膜外定向缓释给药的研究 1.本研究首次研制出单向NG卜胶原缓释药膜，它可以在家兔体内胶原酶的作用下释放出NGF并在无任何促进剂辅助作用的情况下透过眼球壁进入眼内，并在玻璃体内产生蓄积作用，其峰浓度较高，消除半衰期较长，药物浓度波动较小。 2.单向NGF一胶原缓释药膜具有巩膜外定向缓释给药的特点，可根据情况多次给药或替换，避免了玻璃体内注射带来的各种眼内损害和结膜下注射的缺点，是一种安全有效的给药系统。