蔷薇藻活性产物的代谢调控及藻蓝蛋白的分离纯化

来源 :福建师范大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:gymc2009
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蔷薇藻是属于红藻门的一种海洋单细胞微藻,其生长过程中可以产生胞外多糖、藻胆蛋白等生物活性物质。蔷薇藻具有易培养、繁殖迅速的特点,可用光生物反应器进行大规模培养。   选用硝酸钾和尿素调控蔷薇藻培养基中的氮源,研究发现:(1)以硝酸钾作为氮源,含氮量在1.85~296mmol/L之间,蔷薇藻都能保持良好的生长;当含氮量为3.7mmol/L时,可以获得最大的生物量和藻蓝蛋白量,分别为1.64g/L和28.32mg/L,比用KOCK培养基培养分别提高了5.13%和15.94%;当含氮量为296mmol/L时,可获得最大胞外多糖量,为1627.25mg/L,提高了254.87%。(2)以尿素为氮源,含氮量在1.85~29.6mmol/L之间,藻细胞都能保持良好的生长;当含氮量为14.8mmol/L时,可以获得最大的生物量、藻蓝蛋白和胞外多糖含量,分别为1.98g/L、33.02mg/L和566.67mg/L,比用KOCK培养基培养分别提高了26.92%、23.58%和35.22%。(3)硝酸还原酶(NR)的活性与蔷薇藻的生长状况呈正相关,但是,在同等浓度下,以硝酸钾为唯一氮源,其NR活性远远高于以尿素为唯一氮源时的NR值。超氧化物歧化酶(SOD)的活性随着含氮量的增大而升高,含氮量相同时,以尿素为唯一氮源,其SOD活性高于以硝酸钾为唯一氮源时的SOD值。   通过分离纯化蔷薇藻的藻蓝蛋白,研究发现:(1)用20%饱和度的硫酸铵去除杂蛋白,用40%饱和度的硫酸铵沉淀目的蛋白,得到藻蓝蛋白的纯度为1.26。将此样品过DEAE Sepharose FF离子交换柱,用含0.25M NaCl的pH7.0的PBS洗脱液,获得的藻蓝蛋白纯度为3.92。(2)紫外可见光谱图显示纯化后的藻蓝蛋白在620nm处有最大的特征吸收峰。SDS-PAGE考马斯亮蓝染色的结果表明,蔷薇藻的藻蓝蛋白有两个亚基,分子量分别为18和22kDa。氨基酸检测结果表明,藻蓝蛋白含有17种氨基酸,含量最多的是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和丙氨酸,分别占藻蓝蛋白总量的1.89%、1.64%、1.53%和1.48%,四者总和占氨基酸总含量的41.92%。   在研究藻蓝蛋白的稳定性过程中,发现藻蓝蛋白的稳定性并不高。通过从pH、温度、光照、食品添加剂和金属离子等几个因素对藻蓝蛋白稳定性的影响的研究可知:藻蓝蛋白在pH7.0时最为稳定,过酸和过碱都破坏它的稳定性;低温有利于保持藻蓝蛋白的活性,25℃下,恒温一个小时,藻蓝蛋白的光吸收值依然较高,存率高达99.82%;藻蓝蛋白的长期保存,需放置在4℃或是更低的温度下;在避光条件下,藻蓝蛋白有较高的稳定性;适当浓度的蔗糖和葡萄糖都有利于藻蓝蛋白的保存;在所研究的七种金属离子中,在实验浓度范围内,高浓度的锰离子和铝离子(10-3mol/L)有利于维持藻蓝蛋白的稳定性,其放置十天后的吸光值都明显高于蒸馏水对照组。藻蓝蛋白溶于镁离子和钠离子溶液中,在所设置的几个浓度内,吸光值均低于对照组:当锌离子或铁离子浓度为10-3和10-4mol/L时,藻蓝蛋白的吸光值高于对照组,低离子浓度下不利于保存藻蓝蛋白;当藻蓝蛋白溶于铜离子溶液中时,高浓度的铜离子严重破坏藻蓝蛋白的稳定性,低离子浓度对其破坏性更小。   通过研究蔷薇藻藻蓝蛋白的体外抗氧化活性,实验结果表明,该蛋白具有良好的抗羟自由基、抗亚油酸自动氧化、抗超氧阴离子自由基和较高的总抗氧化能力,DEAE Sepharose FF离子交换柱层析后的藻蓝蛋白比粗藻蓝蛋白在同等浓度下具有更高的抗氧化性。在实验浓度范围内,藻蓝蛋白的抗氧化活性随着其浓度提高而增强,呈剂量依赖效应。0.48mg/mL的蔷薇藻的粗藻蓝蛋白和纯藻蓝蛋白对羟自由基的清除率分别为77.05%和97.84%:亚油酸自动氧化抑制率分别为59.36%和70.58%;抗超氧阴离子的活力分别为499.12和618.89U/L;蔷薇藻的粗藻蓝蛋白和纯藻蓝蛋白总抗氧化活性分别为5.22和8.13U/mL。纯度对藻蓝蛋白的抗氧化活性有很大的影响,纯化后的藻蓝蛋白比粗藻蓝蛋白具有更高的抗氧化能力。
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