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背景和目的:创面修复可分为四个阶段:止血期、炎症期、增殖期和重塑期,而免疫细胞和细胞因子在创面愈合过程中起着重要作用。其中巨噬细胞在修复过程中发挥着关键的调控作用,它能吞噬病原体及坏死组织,促进成纤维细胞增殖分化,并促进肉芽组织形成。在正常情况下,巨噬细胞处于静息状态;当受到外界刺激时,巨噬细胞可迅速激活为具有强大抗病原微生物的能力的活化状态。根据巨噬细胞活化状态的不同,可将其分为:促炎M1型巨噬细胞和旁路替代途径激活的抗炎M2型巨噬细胞。在创面愈合过程中,巨噬细胞暴露于干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和损伤相关的分子模式（damage associated molecular pattern molecules,DAMPs）等警报素（alarmins）后,被激活转化为M1巨噬细胞。M1巨噬细胞可以释放如白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、TNF-α和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）等初始促炎因子,为炎细胞的浸润提供微环境。此外,M1巨噬细胞还参与血管生成的启动,并帮助新生血管稳定融合。随着创面愈合进入增殖期,M1巨噬细胞转化为高表达CD163、CD206和CD301b的M2巨噬细胞。M2巨噬细胞分泌抵抗素样分子α（Resistin-like moleculesα,RELMα）、白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）、精氨酸酶1（Arginase 1,Arg1）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）和血小板源性生长因子β（platelet-derived growth factor,PDGF-β）等细胞因子,促进创面再上皮化、血管生成和成纤维细胞的增殖、迁移,减轻炎症反应,增强伤口修复。若创面愈合过程中免疫反应失调,创面中促炎表型的M1巨噬细胞的数量过多,而抗炎表型的M2巨噬细胞的数量较低,创面修复周期无法从炎症期过渡至增殖期,会将导致伤口延迟愈合甚至不愈合。光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）是基于光、光敏剂（photosensitizer,PS）和分子氧之间的相互作用,用于疾病的诊断和治疗的新技术。盐酸氨基酮戊酸（aminolevulinic acid,ALA）是生物体内血红蛋白合成途径中原卟啉IX（protoporphyrin IX,Pp IX）的代谢前体,后者受到特定波长的光/激光的激发可以发生光化学反应。ALA介导的PDT（ALA-PDT）已在临床上广泛地应用于寻常痤疮、玫瑰痤疮、病毒性疣和浅表肿瘤等皮肤疾病的治疗中,并取得了较好的疗效。高剂量的PDT可产生高剂量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）使靶细胞坏死凋亡,常用于肿瘤性疾病的治疗。而低水平的ROS是调节细胞增殖和分化的第二信使,我们的研究表明低剂量的PDT生成的可控ROS与创面中的炎症反应相互作用有利于创面的愈合。随着对光动力机制的深入研究,低剂量光动力对机体免疫反应的影响越来越受到研究人员的关注。低剂量PDT可以加快创面愈合的进程,同时巨噬细胞是创面愈合过程中关键调控因素,而PDT是否通过影响巨噬细胞的功能和极化进程来促进创面愈合尚无深入研究。因此,本课题通过体内外研究旨在探讨ALA-PDT促进创面愈合巨噬细胞（bone marrow derived macrophages,BMDMs）极化的影响及机制。方法:1.以小鼠皮肤全层缺损创面模型为研究对象,探讨ALA-PDT在小鼠外科创面愈合中的疗效和作用机制。分为空白对照组、单纯ALA组、单纯光照组和ALA-PDT组。采用179 m M ALA避光封包3h,LED红光照光剂量为6J/cm~2,检测不同时间点的伤口愈合率、肉芽组织形成、局部炎细胞浸润情况和M1/M2巨噬细胞分布情况;2.以小鼠原代骨髓巨噬细胞（BMDMs）为研究对象,通过条件培养基诱导获得M1和M2巨噬细胞,用流式细胞术、RT-q PCR（Real Time quantitative PCR）和WB（western blot）对获得的成熟BMDMs及M0、M1和M2巨噬细胞进行表型和极化诱导鉴定;3.用流式细胞术检测小鼠原代骨髓巨噬细胞（M0、M1和M2巨噬细胞）孵育ALA不同时间后细胞内Pp IX含量,确定ALA的孵育时间。4.用CCK8法检测不同浓度ALA（0-4m M）与光照剂量（0-4J/cm~2）对原代小鼠骨髓巨噬细胞（M0、M1和M2巨噬细胞）活性的影响,选取合适处理参数进行后续实验;5.用RT-q PCR和WB检测ALA-PDT处理细胞后i NOS和Arg1表达情况。6.用WB检测ALA-PDT处理原代骨髓巨噬细胞（M0、M1和M2巨噬细胞）后在不同时间点（0min、15min、30min和60min）其p-NF-κBp65和NF-κBp65信号通路蛋白表达情况。结果:1.在动物模型上,急性创面予以ALA-PDT处理后,伤口的愈合速度明显优于对照组。在创面愈合早期,PDT能促进向M1巨噬细胞极化,增加炎细胞浸润,形成丰富肉芽组织来快速封闭伤口。在创面愈合中后期,PDT能促进向M2巨噬细胞极化,抑制炎细胞浸润,促进肉芽组织消退以促进伤口的愈合。2.经流式细胞术鉴定CD11b和F480双阳性的成熟骨髓来源巨噬细胞占总细胞数的96.8%。相对于M0巨噬细胞,M1巨噬细胞的促炎因子i NOS基因和蛋白表达显著提高,M2巨噬细胞的抑炎因子Arg1基因和蛋白表达显著升高。表明实验过程中原代骨髓巨噬细胞（BMDMs）的获取,及随后的M1/M2巨噬细胞的诱导是均是成功的,可用于完成后续实验。3.ALA-PDT可提高骨髓来源的巨噬细胞（M0、M1和M2巨噬细胞）Arg1基因和蛋白表达,抑制i NOS基因和蛋白表达。4.ALA-PDT处理15min、30min和60min后骨髓来源的巨噬细胞（M0、M1和M2巨噬细胞）的磷酸化的NF-κB p65水平显著降低。结论:1.局部应用ALA-PDT治疗小鼠外科创面可通过调节肉芽组织的形成及消退、炎细胞浸润和M1/M2巨噬细胞的极化来促进创面愈合。2.PDT可提高M2巨噬细胞相关抑炎因子Arg1表达,抑制M1巨噬细胞相关促炎因子i NOS表达,从而促进创面愈合。3.PDT可通过抑制NF-κB信号通路调控M1/M2巨噬细胞极化。