卒中仍是当代社会致死致残的重要原因之一,许多卒中的幸存者都留下了终生的严重残疾。而缺血性卒中占了整个卒中的80-85%。目前对急性脑梗死的诊断和预后判断主要依靠病史、查体和影像学资料。但是影像学检查的费用较昂贵,耗费时间长,且部分患者的影像表现不典型。考虑到目前溶栓治疗需限定4.5小时的时间窗,生物标志物的运用有可能加快诊断并影响治疗方案的选择。准确地预测卒中的预后对临床实践中的实施个性化治疗是重要的。想要监测患者在缺血性卒中急性期和恢复期的脑改变,血液标本是最易获得的材料。mi RNAs是一种近年发现的内源性非编码小RNA,它通过与其目标m RNA的3’-端非翻译区结合在转录后水平抑制基因的表达。在过去的十年间,有许多证据证明了它们在各种人类疾病(包括癌症和心血管疾病)中的作用。而且有学者发现血液中的核酸酶并不能破坏循环血mi RNAs。有学者深入研究发现血液中的mi RNAs含量的多次检测结果是稳定的,并且其含量高低与疾病的严重程度相关。但是,缺血性卒中的mi RNAs的研究仍处于其早期阶段。mi RNAs是一组具有独特基因功能的内源性核糖核酸调节子。它对解释脑梗死的病理生理过程的潜在机制显示了巨大的潜力。它在诊断和预测脑梗死的预后方面可能有重要的作用。因此,我们假设有特异的血浆mi RNAs表达谱可以提示急性脑梗死的病理生理过程和疾病状态,这些循环mi RNAs中的一部分有可能成为急性脑梗死无创性早期诊断的生物标志物并预测其预后。本研究的主要目的有二:1、建立实验室血浆mi RNAs高效、灵敏、准确的检测平台;2、探讨血浆mi RNAs作为急性脑梗死早期生物标志物的潜在价值。本研究涉及的主要技术和方法:血液标本的初步处理和储存,血浆总RNA的抽提,q RT-PCR,血浆mi RNAs芯片,医学统计学。第一部分急性脑梗死循环血mi RNAs芯片表达谱的变化研究目的:研究健康志愿者的血浆mi RNAs含量和分布情况,建立急性脑梗死患者与健康志愿者血浆mi RNAs的差异表达谱。方法:分别采集4例健康志愿者和7例急性脑梗死患者的血浆,以mir Vana PARIS Kit(Applied Biosystem p/n AM1556)提取总RNA,采用Agilent mi RNA芯片技术(19.0version),进行质检、荧光标记、杂交和扫描。以平均信号值>2为有效信号,分析健康志愿者血浆mi RNAs表达谱及急性脑梗死患者与健康志愿者血浆mi RNAs的差异表达谱。结果:1、利用mi RNAs芯片技术可以检测出血浆中142条mi RNAs,其中平均信号强度值小于100的mi RNAs有106条,占总mi RNAs数的74.6%,大部分血浆mi RNAs含量非常微弱。2、除了mi R-21-5p(2.87±5.41)以外其余与脑相关的mi RNAs在健康志愿者血浆中检测不到。3、除mi R-122在芯片中具有有效信号值(72.75±145.15)以外,绝大多数组织特异的mi RNAs在健康人血浆中检测不到信号。4、急性脑梗死患者和健康志愿者血浆mi RNAs表达存在较大差异,11个mi RNAs表达上调,1个表达下调。除mi R-223-3p和mi R-16-5p以外,大部分组织特异的mi RNAs并没有检测出明显的变化。结论:通过mi RNAs芯片可以检测血浆中的mi RNAs,大部分血浆mi RNAs含量非常微弱;大部分与脑相关和组织特异mi RNAs在健康志愿者血浆中含量微弱;急性脑梗死患者和健康志愿者血浆mi RNAs表达存在较大差异,大部分脑相关和组织特异的mi RNAs并没有检测出明显的变化。第二部分循环血mi RNAs定量检测平台的建立和优化研究目的:建立血浆mi RNAs的科学的检测平台,探讨技术细节以形成标准化流程。方法:1、以两步法分离血浆,以TRI REAGENT BD和S/P RNAiso kit进行血浆总RNA的抽提,比较两种方法的得率。2、以SYBR Green法【Rever Tra Ace Qpcr RT Kit和Real-time PCR Master Mix(TOYOBO)】和S-Poly(T)法进行血浆mi RNAs的q RT-PCR检测,初步比较两种方法的灵敏度和特异度。3、两种体系的荧光定量PCR的扩增曲线的线性范围的研究。结果:1、抽提血浆总RNA TRI REAGENT BD方法的得率比S/P RNAiso kit低。2、q RT-PCR的两种方法相比,Poly(A)加尾法的灵敏度较好,SYBR Green的特异度较好。3、S-Poly(T)法q RT-PCR体系中对于外源性的参比基因cel-mi R-54,当其CT值在27以上时,其CT值与浓度的关系已不符合理想的线性关系;对于内源性的待测基因mi R-16,CT值大于28时不再与浓度成线性关系。结论:以两步法分离血浆,以S/P RNAiso kit抽提血浆总RNA;以cel-mi R-54作为外源性的参比基因;以S-Poly(T)法行q RT-PCR检测mi RNAs;内源性的待测mi RNAs当CT值大于28时不再与浓度成良好的线性关系。第三部分循环血mi RNAs早期诊断急性脑梗死的价值及其与预后关系的研究目的:1、在小样本的急性脑梗死患者和对照人群中,评价候选标志物诊断急性脑梗死的价值,随后将慢性脑梗死也纳入评价体系之中;2、在小样本的急性脑梗死患者中,评价候选标志物判断患者预后的价值。方法:1、采集急性脑梗死患者27例、慢性脑梗死患者28例、健康志愿者26例的血浆,利用q RT-PCR进行mi RNAs定量分析;2、挑选芯片的差异表达谱中荧光信号较高的mi RNAs并结合文献确定候选标志物,分析其在急性患者和健康者之间的差异,并分析其在急性、慢性脑梗死患者、健康志愿者之间的差异;3、将急性脑梗死患者分为预后不佳组(MRS 3-6)和预后良好组(MRS 0-2),挑选在急性患者和健康志愿者之间有差异的mi RNAs,进一步分析其在预后不佳组和预后良好组之间的差异。结果:1、急性患者与志愿者二组评价时,急性脑梗死患者血浆中mi R-16和let-7i平均水平较健康志愿者明显升高,具有显著性差异(p<0.05),而mi R-106b,mi R-130a,mi R-223,mi R-25,mi R-140,mi R-4454在两组之间无显著性差异。三组人群统一评价时,mi R-16和let-7i都能区分急性患者和志愿者,但let-7i能区分急性和慢性脑梗死患者,而mi R-16不能。let-7i对急性脑梗死特异性更强。2、预后不良组的mi R-16和let-7i平均表达水平均较预后良好组显著升高,两组之间有统计学差异(p<0.05)。结论:来自于芯片差异表达谱的mi R-16和来源于文献复习的let-7i在急性脑梗死患者和健康志愿者的血浆中有显著性差异,其中let-7i可以区分急性和慢性脑梗死。其对急性脑梗死诊断价值更高,可用于排除脑梗死复发。mi R-16和let-7i在预后不佳和预后良好的急性脑梗死患者的血浆之间有显著性差异。小结:本研究关注急性脑梗死的早期诊断,结合mi RNAs芯片及荧光定量PCR的最新技术进展,全面分析了健康志愿者的血浆mi RNAs表达谱,急性脑梗死患者和健康志愿者的血浆mi RNAs差异表达谱,建立了循环血mi RNAs科学的检测平台,结合小样本的临床患者,研究了芯片差异表达的mi RNAs在急性脑梗死后血浆中的变化情况,评价了血浆mi RNAs在急性脑梗死中的早期诊断及预后判断的价值,不仅阐明了血浆mi RNAs可作为急性脑梗死早期诊断潜在的生物标志物的概念,筛选并鉴定了以let-7i为代表的两个具有潜在临床价值的mi RNAs,同时提出了从血浆芯片的差异表达谱出发来寻找急性脑梗死血浆生物标志物的研究思路。