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目的:结直肠癌是人类最主要的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈上升趋势。肝脏是结直肠癌出现远处转移最常见的靶器官,结直肠癌肝转移也是影响患者预后最主要的因素。对于术后复发转移和不可切除的结直肠癌肝转移患者,以化疗为主的综合治疗是最常见的治疗手段。随着肿瘤分子靶向研究的不断深入,靶向药物与化疗药物联合治疗的疗效越来越好,但化疗耐药仍然是影响肿瘤复发和转移最关键的因素。肿瘤微环境在化疗耐药方面发挥重要的作用,既往研究发现肿瘤细胞和基质细胞在不同营养条件下发生的代谢途径改变赋予肿瘤细胞更强的增殖和耐药能力。外泌体作为传递信息物质的载体介导肿瘤细胞和基质细胞之间的串话。近年来,研究发现外泌体调节的肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）间的代谢重编程在肿瘤细胞的侵袭、转移和耐药方面扮演重要角色。肿瘤细胞的快速增殖导致肿瘤内部乏氧,本研究的目的是探讨在肝转移微环境中,常氧结直肠肿瘤细胞外泌体通过驯化肝脏星形细胞调节乏氧肿瘤细胞的代谢从而促进化疗耐药的机制,研究结果可能为结直肠癌肝转移化疗耐药患者提供新的预测标志物和潜在治疗靶点。研究方法:1、采用电镜、纳米粒子跟踪法和蛋白免疫印迹技术（Western Blot）鉴定结直肠肿瘤细胞分泌的外泌体;2、采用免疫荧光和Western Blot法检测常氧结直肠肿瘤细胞外泌体能否活化肝脏星形细胞（hepatic stellate cells,HSCs）;3、采用酶联免疫吸附测定实验检测外泌体处理的肝脏星形细胞分泌IL-6能力;4、采用流式细胞术检测外泌体处理的肝脏星形细胞葡萄糖摄取能力;5、采用CCK8检测外泌体处理的肝脏星形细胞培养上清对SN38（伊立替康代谢物）刺激的乏氧肿瘤细胞增殖的影响;6、采用流式细胞术（Annexin V/PI双染法）和Western Blot法检测外泌体处理的肝脏星形细胞培养上清对SN38刺激的乏氧肿瘤细胞凋亡的影响;7、采用Mann-Whitney U检验和Kaplan–Meier分析患者血浆IL-6水平与临床病理特征及生存的关系;8、采用免疫组化法检测结直肠癌患者肝转移灶中单羧酸转运体（monocarboxylate transporters 1,MCT1）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase B,LDHB）表达水平与伊立替康耐药的关系;9、统计学分析:每次实验结果均进行3次重复实验,采用SPSS 19.0软件分析数据。P<0.05有统计学差异。结果:1、HSCs摄取结直肠肿瘤细胞外泌体并且被活化成为肌成纤维细胞（myofibroblasts,MFs）。首先对超速离心法提取的结直肠肿瘤细胞外泌体进行鉴定,通过透射电子显微镜观察到外泌体典型的杯状形态。纳米粒子跟踪法分析外泌体的大小为30-150 nm。Western Blot检测到外泌体标记蛋白CD9和TSG101的表达。为探索肿瘤细胞外泌体能否被肝脏星形细胞摄取,用DiO（绿色）标记外泌体,Dil（红色）标记HSCs,二者共培养48小时后,通过荧光显微镜观察到红色的HSCs中包含绿色外泌体。通过免疫荧光和Western Blot实验,结果显示常氧结直肠肿瘤细胞外泌体处理后的HSCs高表达α-SMA（MFs的典型标志物）。2、外泌体活化的HSCs分泌IL-6增多和糖酵解能力增强。首先通过酶联免疫吸附测定实验检测到MFs培养上清中IL-6的浓度显著高于HSCs（P<0.05）。同时,Western Blot检测到MFs细胞核中NF-κB表达明显高于HSCs,当NF-κB抑制剂（BAY11-7082）和外泌体同时处理HSCs时,结果发现MFs分泌的IL-6明显降低（P<0.05）。因此,结直肠肿瘤细胞外泌体能够通过激活NF-κB促进IL-6的分泌。接下来,探索结直肠肿瘤细胞外泌体能否调节HSCs的代谢重编程,MFs和HSCs与葡萄糖类似物（2-NBDG）孵育1小时后,MFs荧光强度显著高于HSCs（P<0.001）,同时还发现MFs培养上清中的乳酸含量明显高于HSCs（P<0.05）,并且MFs中GLUT1和LDHA的表达明显增多。3、结直肠肿瘤细胞外泌体通过传递p-ERK和p-AKT促进HSCs分泌IL-6和增强糖酵解。首先Western Blot检测到MFs中p-ERK和p-AKT的表达明显升高,并且发现结直肠肿瘤细胞外泌体中表达p-ERK和p-AKT蛋白。为验证肿瘤细胞通过外泌体传递p-ERK和p-AKT激活HSCs的信号通路,使用1μM p-AKT抑制剂（MK226）和10μM p-ERK抑制剂（U0126）处理肿瘤细胞,发现肿瘤细胞外泌体p-ERK和p-AKT表达降低并且HSCs中p-ERK和p-AKT不再被激活。为进一步验证MFs中p-AKT和p-ERK的调控作用,使用MK226和U0126抑制MFs的p-AKT和p-ERK,发现MK226和U0126能够抑制MFs分泌IL-6,还发现MK226和U0126处理MFs时,2-NBDG摄取和乳酸生成明显减少,并且与HSCs无明显差异（P>0.05）。4、MFs通过分泌IL-6促进乏氧肿瘤细胞SN38耐药。首先使用化学诱导剂CoCl2模拟乏氧微环境,MFs和HSCs培养上清培养SN38刺激的乏氧肿瘤细胞LoVo和HCT116 48小时后,CCK-8检测结果表明MFs培养上清中细胞活力明显强于HSCs（P<0.05）。流式细胞术发现MFs培养上清中SN38刺激的乏氧LoVo和HCT116细胞凋亡明显减少（P<0.001）。Western Blot结果显示,与HSCs相比,MFs组肿瘤细胞中促凋亡蛋白（Bax）的表达降低,而抗凋亡蛋白（Bcl-2）的表达增加。为探索MFs是否通过分泌IL-6促进乏氧肿瘤细胞耐药,使用IL-6中和抗体处理SN38刺激的乏氧LoVo和HCT116,结果发现MFs培养上清中细胞活力明显降低（P<0.001）,细胞凋亡明显增加（P<0.001）。5、MFs培养上清中IL-6通过调节乏氧肿瘤细胞乳酸代谢促进SN38耐药。首先通过Western Blot检测到MFs培养上清能够增加SN38刺激的乏氧肿瘤细胞中MCT1和LDHB的表达。ATP能量测定结果显示,与HSCs相比,MFs培养上清中SN38刺激的乏氧LoVo和HCT116能够产生更多的ATP（P<0.001）。为验证MFs培养上清通过乳酸代谢促进SN38耐药,使用MCT1 siRNA和LDHB siRNA处理LoVo后,MFs培养上清中SN38刺激的乏氧LoVo产生的ATP和细胞活力明显降低（P<0.001）,细胞凋亡明显增加（P<0.001）。还发现IL-6中和抗体处理MFs培养上清中SN38刺激的乏氧肿瘤细胞时,MCT1和LDHB的表达明显降低,同时ATP的产生明显减少（P<0.05）。6、MFs培养上清通过激活IL-6/STAT3通路增强乏氧肿瘤细胞乳酸代谢进而促进耐药。首先Western Blot检测到MFs培养上清中SN38刺激的乏氧LoVo和HCT116中p-STAT3的表达明显增加,并且IL-6中和抗体能够抑制p-STAT3的表达。为探索p-STAT3是否发挥促进SN38耐药的作用,使用p-STAT3抑制剂（Stattic）处理SN38刺激的乏氧LoVo和HCT116时,CCK8结果发现MFs培养上清中细胞活力明显降低（P<0.001）,并且流式细胞术发现MFs培养上清中细胞凋亡明显增加（P<0.001）。还发现Stattic和STAT3 siRNA能够降低MFs培养上清中SN38刺激的乏氧肿瘤细胞LDHB和MCT1的表达,并且Stattic和STAT3 siRNA能够降低MFs培养上清组肿瘤细胞ATP的产生（P<0.001）。7、结直肠癌肝转移患者血浆IL-6水平升高与伊立替康耐药和较差预后明显相关。收集78例结直肠癌肝转移患者资料,发现伊立替康治疗耐药患者血浆IL-6水平显著高于敏感患者（P<0.0001）,并且与CA199水平,是否合并肝外转移及肝转移灶个数明显相关（P<0.05）。免疫组化结果分析发现伊立替康耐药结直肠癌患者肝转移灶中MCT1和LDHB的表达明显升高（P<0.05）。结论:1、常氧结直肠肿瘤细胞外泌体能够将HSCs活化成为MFs。2、结直肠肿瘤细胞通过传递外泌体p-ERK和p-AKT促进HSCs分泌IL-6和增强糖酵解。3、MFs培养上清通过激活IL-6/STAT3通路增强乏氧肿瘤细胞乳酸代谢促进其SN38耐药。4、结直肠癌肝转移患者血浆IL-6水平与伊立替康耐药和预后明显相关。5、伊立替康耐药的结直肠癌患者肝转移灶中MCT1和LDHB的表达明显升高。