论文部分内容阅读
心血管衰老指心脏衰老与血管衰老,是多种急、慢性临床疾病的致病因素,对老年人的生理、心理均产生巨大影响。因此,探索延缓心血管衰老的研究十分重要。近年来研究发现,线粒体在细胞的能量代谢、生物合成和调节细胞程序性死亡等过程中有着重要作用。随着年岁增加,线粒体的完整性、生物能量效率等均下降,产生大量与衰老相关的疾病表型。已有实验证明D-半乳糖可以短时间内诱导亚急性衰老动物模型,其衰老机制及特点与自然衰老类似。前期课题组的研究已证明,益气活血养阴方中部分成分可以延缓自然衰老大鼠、小鼠以及高糖高脂诱导的小鼠心脏、血管老化过程。因此通过构建D-半乳糖诱导亚急性衰老小鼠模型,探索线粒体能量代谢与心血管衰老之间的关系,并探究益气活血养阴方通过保护线粒体能量代谢功能来延缓心脏与主动脉衰老具有重要意义。第一部分D-半乳糖诱导小鼠心脏与主动脉衰老及益气活血养阴方的干预作用目的:通过构建D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠模型,观测心脏与主动脉衰老情况及益气活血养阴方的干预作用。方法:通过颈背部注射D-半乳糖（180mg/kg）来构建亚急性衰老小鼠模型,造模2周后分组进行持续10周的药物干预。实验动物随机分为空白对照组、衰老模型组、二甲双胍组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组。在取材前进行整体实验:旷场试验观察小鼠焦虑状态和活动能力;抓力测试检测分析小鼠的体能状态;激光散斑测试观察小鼠背部微循环血流状态;检测血清中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性与丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量;HE染色观察心脏、主动脉的形态,分析主动脉的中内膜厚度增减;免疫组化染色观察心脏、主动脉中晚期糖基化终末产物（advanced glycationend products,AGE）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotein-2,MMP-2）、抑癌基因P53（tumor suppressor,P53）、血管内皮生长因子 VEGF（vascular endothelial-derived growth factor,VEGF）表达水平;对心脏、主动脉组织的端粒相对长度以及端粒酶活性进行检测。结果:（1）与空白对照组相比,衰老模型组:体重在取材前降低（P<0.05）;旷场实验中,直立次数增多（P<0.05）,穿格个数显著增多（P<0.01）;在抓力测试中,抓力较弱（P<0.05）,其归一化抓力明显减弱（P<0.01）;激光散斑实验中,皮肤血流灌注量减少（P<0.05）;血清中SOD活性明显降低（P<0.01）;MDA含量增加（P<0.05）;小鼠心脏组织中,心肌细胞排列不齐、心肌纤维断裂增多,AGE蛋白表达明显升高（P<0.01）,MMP-2、P53蛋白表达升高（P<0.05）,端粒相对长度明显缩短（P<0.01）;小鼠主动脉组织中,主动脉形态结构异常,中内膜紊乱且增生（P<0.05）,AGE、MMP-2、P53蛋白表达提升（P<0.05）,VEGF蛋白表达明显降低（P<0.01）。（2）与衰老模型组相比,中药中剂量小组小鼠归一化抓力增强（P<0.05）,皮肤血流灌注量增大（P<0.01）,SOD活性增强（P<0.01）,MDA含量降低（P<0.05）;小鼠心脏组织中,心脏形态较为完整,所有给药组AGE蛋白的表达下调（P<0.05）,中药中、高剂量组MMP-2蛋白的表达下调（P<0.01）,中药中、高剂量组P53蛋白的表达下调（P<0.05）,二甲双胍组心脏端粒酶的活性提高（P<0.05）,中药低、中剂量组心脏端粒酶的活性提高（P<0.01）,中药中剂量组端粒相对长度增长（P<0.01）;小鼠主动脉组织中,二甲双胍组、中药低剂量组、中药中剂量组主动脉中内膜厚度减少（P<0.05）,二甲双胍组、中药中剂量组AGE蛋白的表达下调（P<0.05）,中药低剂量组MMP-2蛋白表达下调（P<0.05）,二甲双胍组、中药中剂量组P53蛋白的表达下调（P<0.05）,二甲双胍组、中药中剂量组、中药高剂量组VEGF蛋白的表达上调（P<0.01）。结论:小鼠在经过D-半乳糖注射后形成亚急性衰老状态,亚急性衰老小鼠体内出现心脏和主动脉衰老的表现,即D-半乳糖可以诱导小鼠心脏和主动脉衰老;益气活血养阴方能够改善经D-半乳糖诱导的小鼠心脏与主动脉衰老表现,延缓了心血管衰老的发展。第二部分衰老小鼠心脏与主动脉线粒体能量代谢变化以及益气活血养阴方的保护作用目的:观测D-半乳糖诱导的衰老小鼠体内能量代谢的变化及益气活血养阴方的保护作用。方法:以D-半乳糖诱导衰老小鼠心脏、主动脉组织样本为研究对象。荧光显微镜下观察心脏、主动脉冰冻切片的荧光强度,观测线粒体ROS（Mitochondrial ROS,mtROS）、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）含量,判断线粒体受损情况;采用比色法、微量法检测小鼠心脏组织中线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅲ、Ⅴ活性,采用Western blot法来观测小鼠主动脉组织中复合体I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V蛋白的表达,以判断线粒体能量代谢功能受损情况。结果:（1）与空白对照组相比,衰老模型组:小鼠心脏组织中,mtROS水平显著增加（P<0.01）、MMP下降（P<0.05）、线粒体复合体I的活性显著降低（P<0.01）,复合体Ⅱ、复合体Ⅲ、复合体Ⅳ、复合体Ⅴ活性均明显下降（P<0.05）;小鼠主动脉组织中,mtROS含量上升（P<0.05）、MMP下降（P<0.05）、复合体I、复合体Ⅳ的蛋白表达显著下降（P<0.01）。（2）与衰老模型组相比,小鼠心脏组织中,二甲双胍组、中药高剂量组mtROS含量显著下降（P<0.01）,中药中剂量组mtROS含量下降（P<0.05）,二甲双胍组、中药低剂量组MMP上升（P<0.01）,二甲双胍组、中药高剂量组线粒体复合体Ⅱ活力提升（P<0.05）,中药中剂量组线粒体复合体Ⅱ活力显著提升（P<0.01）,二甲双胍组、中药低剂量组、中药中剂量组线粒体复合体Ⅲ活力提高（P<0.05）,二甲双胍组、中药中剂量组线粒体复合体Ⅳ活力提高（P<0.05）;小鼠主动脉组织中,二甲双胍组、中药高剂量组mtROS含量下降（P<0.05）,全部中药给药组MMP上升（P<0.05）,二甲双胍组线粒体复合体Ⅰ活力显著升高（P<0.01）,二甲双胍组复合体Ⅱ活力升高（P<0.05）,二甲双胍组、中药高剂量组线粒体复合体Ⅳ活力显著提高（P<0.01）,二甲双胍组、中药中、高剂量组线粒体复合体V活力显著提高（P<0.01）。结论:D-半乳糖诱导的衰老小鼠存在心脏与主动脉线粒体损伤,能量代谢功能下降的改变,可能是致心血管衰老的重要因素;益气活血养阴方可以减少线粒体ROS含量,增高膜电位,提高线粒体能量代谢相关复合体活力,通过保护线粒体能量代谢功能以延缓心脏和主动脉衰老。综合两部分实验结果,可以推测线粒体能量代谢功能失调可能与心血管衰老之间存在密切联系。益气活血养阴方可能通过降低mtROS含量,提高MMP,保护线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性的机制来延缓心脏和主动脉衰老。