血管增生(neovasculsrization)，即从已存在的毛细血管网上大量生成新生血管的过程，是肝癌等实体性肿瘤生长和转移的关键环节。新生血管的长入不仅提供肿瘤生长需要的营养物质和氧气以及带走代谢废物，内皮细胞还为肿瘤组织生长提供促进因子如FGF-1和FGF-2等，同时新生血管形成更是癌细胞广泛浸润、转移和肿瘤复发的基础。应用血管增生抑制因子阻断肿瘤新生血管形成的饥饿疗法为克服肝癌细胞转移和减少肿瘤复发提供了新的视野，有望成为今后肝癌治疗的突破口。 在已发现的众多的血管抑制因子中，人纤溶酶原K5是目前发现的分子量小、性质稳定、活性最强的血管增生抑制剂之一。人纤溶酶原(plasminogen)含有5个环状结构域(kringles)，每个环由80个氨基酸残基组成，含3个二硫键，形成双环状构象。水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin(kringles 1-4)，kringles 1-5，kringles 1-3和kringles 5(K5)。血管抑素(Angiostatin)用于肿瘤的治疗已进入临床工期试验阶段。相比较于另一种血管抑制因子血管抑素(分子量约45KDa)，K5具有分子量小(16KDa)、性质稳定且活性更强(动物实验表明，Angiostatin的EI50约为70nmol/L，K5的EI50约为30nmol/L)的优点，K5还可抑制内皮细胞的迁移及诱导内皮细胞凋亡。 K5具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值和较血管抑素更多的优势，但K5完整多肽已获美国专利保护，无自主知识产权。因此，我们既往的研究己对K5基因进行了改造，获得比K5分子量更小、性质更稳定的K5突变体Ⅰ(K5 mutantl，K5 mutl)基因工程纯化蛋白。观察其抑制肝癌血管生成和肿瘤生长的作用及其效果，从而进一步证明K5 mutl具有更强的抑制肝癌血管生成和肿瘤生长的作用，为治疗新生血管丰富的肝癌等恶性肿瘤提供新的并拥有自主知识产权的基因工程药物。为了优化K5 mutl在原核系统的表达，进一步降低投入，增大产出，提高K5 mutl在原核系统pETT22b-BL21的单位表达量，本研究第一部分拟对原核系统中各种可能影响表达的因素如：抗生素浓度、PH、OD<,600>值、IPTG终浓度、诱导温度、诱导时间与细胞定位等进行研究，获得优化的表达条件，为工业化大规模发酵生产生物蛋白药物奠定基础，并对获得的基因重组蛋白就其生物活性，进行细胞学上的检测。 既往获得的融合蛋白K5mutl，在N端的融合部分含有人工构建的蛋白质标签His-tag等部分，可能在后续体内应用中导致机体产生免疫抗体，为了避免该情况的发生，本研究第二部分拟在原有重组体K5mutl的基础上，对其进行改建，获得新重组体K5mutl-rEK，以使其重组蛋白表达后能在重组肠激酶的特异性切割作用下，去除原重组蛋白在N端的融合部分，获得具有天然氨基酸序列的重组蛋白。 主要研究内容和结果如下： 第一部分K5突变体Ⅰ的优化表达和活性检测 1. 优化K5mutl的各项表达条件。在原有实验方案上，通过分别调整下列可能影响表达的参数：抗生素浓度、PH、OD<,600>值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得K5mutl在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件为：羧苄青霉素浓度为50 μg/ml，PH为7.0的LB培养液中，37℃，摇床230rpm/min，摇菌至OD<,600>值为0.9-1.0，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃诱导表达10h。 2. 获得高纯度可溶性的突变体蛋白。采用优化条件诱导表达的细菌，经冰上超声破壁后，离心取上清，用Ni<2+>-His Bind Resin亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。经DC法测得蛋白浓度为1.5 ug/μl。用凝胶成像系统(GENEGENIUS公司产品)对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达：90﹪。纯化的重组蛋白经Western-blot分析显有明显的免疫杂交带。 3.生物活性的检测。体外细胞学实验显示K5 mutl具有抑制微血管内皮细胞增殖的作用；诱导内皮细胞凋亡的作用；并能特异性抑制微血管内皮细胞的迁移。 第二部分K5突变体Ⅰ的改建及表达纯化 1.对原有KSmutl改建，获得新表达载体KSmutl-rEK。构建具有肠激酶识别序列的5→3引物，以野生型人纤溶酶原K5 cDNA为模板，用PCR方法得到在原K5mutl基因序列N端与融合标签之间，问隔有肠激酶识别序列的DNA片段，定向克隆入原核表达质粒pET28a，重组体转化进大肠杆菌BL21(DE3)。 2.表达纯化K5mutl-rEK蛋白，并进行肠激酶的切割与二次纯化。转化有K5mutl-rEK重组体的表达细胞BL21(DE3)经诱导表达，产物经亲和层析和高浓度甘油透析，透析后的蛋白经肠激酶切割后，再采用第二次亲和层析，获得酶切后的片段，并经SDS-PAGE电泳和免疫印迹(Western-blot)鉴定纯化产物。 结论及研究意义： 1.优化了K5mutl在原核系统pET22b-BL21的表达条件，并获得具有生物活性的高纯度基因工程纯化蛋白，为工业生产提供了基础。 2.构建并获得了具有肠激酶切割位点的重组体K5mutl-rEK。并对诱导后的重组基因蛋白进行了肠激酶的切割与纯化尝试。探索了肠激酶在蛋白质工程下游运用的经验。