在我国,食管癌的发病率和死亡率排名前列,病理类型以食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）为主。无论是联合放化疗还是新辅助化疗,目前铂类药物仍然是ESCC治疗中的基石。然而,铂类药物在ESCC的治疗中的有效率仅为40-60%,且长时间使用后极易出现耐药而发生进展。因此,进一步深入研究ESCC对铂类药物的耐药机制,并探索逆转耐药的新靶点,对于提高ESCC患者的整体疗效和改善其生存预后有着重要意义。铁死亡是一种新型程序性细胞死亡方式,在多种肿瘤耐药过程中发挥重要作用。氧化损伤和抗氧化保护的失衡,及其导致的脂质过氧化物累积是铁死亡发生的关键。其中,谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathioneperoxidase4,GPX4）是发挥抗氧化保护作用最主要的蛋白之一;该酶能够以还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）为底物,催化具有毒性的过氧化磷脂还原成无毒的磷脂醇而阻止铁死亡的发生。研究表明,一些耐药肿瘤细胞的存活依赖于GPX4的高活性,相应的靶向药物有望成为重要的逆转肿瘤耐药新策略。然而,相关的铁死亡通路如何影响ESCC细胞对铂类药物的敏感性还缺乏研究,相关的作用机制也不明确。故我们希望通过该研究来评估铁死亡通路在ESCC对顺铂耐药过程中的地位,并探索其潜在的作用机制。本课题先利用高内涵筛选评估铁死亡相关基因对ESCC细胞对顺铂敏感性的影响,发现铁死亡通路确实在ESCC对顺铂耐药中有重要作用。其中,敲降的热休克蛋白 A5（heat shock protein family A member 5,HSPA5）是最显著增强 ESCC 细胞对顺铂敏感性的基因之一。我们通过慢病毒感染的方法构建了 HSPA5的稳转细胞株,并进行药物敏感性实验验证了该基因敲降对顺铂敏感性的增强作用,而其过表达对敏感性无明显改变。这种顺铂处理后,由HSPA5敲降增加的细胞死亡不仅能够被凋亡抑制剂Z-VAD-FMK部分逆转,也能够被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1部分缓解。此外,HSPA5敲降能够促进Erastin引起的铁死亡,增加过氧化脂质的累积。机制研究发现,HSPA5沉默会引起GPX4的蛋白表达和酶活性的降低,并且细胞内GSH含量升高。进一步实验证实,HSPA5敲降可以通过激活PERK-eIF2α通路抑制GPX4蛋白翻译而下调其蛋白表达。综上所述,该研究揭示了铁死亡通路在食管鳞癌对顺铂耐药中的重要作用,并通过筛选发现HSPA5可能是影响顺铂敏感性的关键分子。进一步机制探索表明,HSPA5的敲降是通过激活PERK-eIF2α通路而降低GPX4蛋白的表达,从而引起细胞更容易发生铁死亡,故能增加对顺铂的敏感性。本课题丰富了对化疗药物治疗食管鳞癌中耐药机制的理解,为逆转药物耐受提供了新思路。肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,死亡率很高,超过85%的肺恶性肿瘤是非小细胞肺癌。其中,肺腺癌（lungadenocarcinoma,LUAD）是非小细胞肺癌最常见的病理类型,其发病率在过去20年中显著增加。针对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）突变的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）对突变型肺癌有一定的治疗效果,然而肺癌患者在TKI治疗后经常出现耐药性。因此,深入研究肺腺癌的发病机制、分子基因分型和新靶点开发具有重要意义。Desmoglein-2（DSG2）是钙粘蛋白家族中一种重要的跨膜糖蛋白,通过形成细胞间桥蛋白连接复合物介导细胞间的黏附和信号传导。DSG2在肿瘤的发生发展中发挥重要作用,并在一些恶性肿瘤如皮肤癌、胃癌、胰腺癌中高表达。以往的研究只关注DSG2在肺癌中的表达,但未阐明DSG2介导的促肺癌进展的分子机制。在本研究中,我们发现DSG2在LUAD细胞系和组织中均高表达,其高表达与LUAD患者的不良预后相关。为了进一步确定DSG2在LUAD发生发展中的作用,我们通过慢病毒载体建立了稳定过表达和沉默DSG2的细胞系,包括肺腺癌细胞H538、H1975和HCC827。随后我们进行了细胞体外实验,包括细胞计数、Transwell试验和奥希替尼IC50测定等。结果提示DSG2过表达促进了细胞增殖和迁移,并增加了它们对EGFR-TKI奥希替尼的耐药性,而沉默DSG2则能逆转这些作用。为了探索DSG2促进肺腺癌进展的潜在机制,我们进一步进行相关分子生物学实验。首先,免疫共沉淀、免疫荧光和细胞组分蛋白分析结果表明DSG2可以稳定细胞膜中的EGFR,而DSG2敲低显著减弱了 EGFR的膜定位。在我们建立的所有细胞系中,DSG2过表达明显增加了 EGFR Tyr845位点的磷酸化水平,但对Tyr1068位点的磷酸化没有影响。此外,DSG2过表达通过Tyr416磷酸化激活了 Src,并减少了抑制性Tyr527位点的磷酸化。接着,Rac1激活实验证实了 Rac1可被外源性过表达的DSG2激活。最后,我们在DSG2过表达的细胞中检测到显著激活的PAK1 Ser423磷酸化。相反,我们的Western blot结果表明DSG2沉默则会通过抑制EGFR-Src-Rac1-PAK1信号通路抑制肿瘤细胞的生长。值得注意的是,DSG2过表达或沉默并未改变这些蛋白质的总体表达。有趣的是,EGFR的免疫沉淀证实了 EGFR和Src之间的相互结合作用,但DSG2沉默使得两者的结合发生解离。在DSG2过表达细胞中进一步用siRNA分别沉默EGFR和Src,这导致下游信号被抑制,这进一步证实了 DSG2通过诱导EGFR和Src磷酸化而增强PAK1信号传导。此外,我们还在培养基中分别加入EGF或奥希替尼处理细胞,结果进一步证明了 DSG2通过上述通路调控LUAD的进展。用EGF处理细胞24小时后,过表达DSG2的细胞中EGFRTyr845和PAK1 Ser423的磷酸化水平增加。此外,与对照细胞相比,DSG2过表达细胞中的EGFR和PAK1磷酸化水平要高得多。正如预期的那样,与未处理的细胞相比,奥希替尼处理24小时导致EGFR Tyr845和PAK1 Ser423磷酸化显著降低。然而,在过表达DSG2的细胞中,奥希替尼的作用并不显著。与体外细胞实验结果一致,使用H1975细胞的裸鼠移植瘤模型表明DSG2能够促进裸鼠体内LUAD细胞的生长并增加了其奥希替尼耐药性。值得注意的是,与未治疗的裸鼠相比,奥希替尼治疗降低了所有裸鼠的肿瘤负荷。对于注射DSG2沉默细胞的裸鼠,奥希替尼的作用更为显着。然而,对于用奥希替尼处理的DSG2过表达细胞移植瘤,它们的大小相对大于对照组。进一步对移植瘤的免疫组化分析表明,与对照组相比,EGFR Tyr845和PAK1 Ser423的磷酸化水平在过表达DSG2的肿瘤中升高,而在DSG2沉默的肿瘤中降低。综上,本研究提示了 DSG2通过EGFR信号通路促进肺癌进展和奥希替尼耐药的最新机制,首次证明了 DSG2通过调节EGFR和Src之间的相互作用诱导Src激活。这种效应促进了下游Src信号传导,特别是促进了 Rac1-PAK1通路,增强了LUAD的细胞增殖、迁移和对奥希替尼的耐药。