论文部分内容阅读
调节性B细胞（regulatory B cell, Breg）是一类具有负向免疫调节作用的B细胞亚群，通过分泌负向免疫调节细胞因子（如IL-10、IL-35）参与机体免疫调节，产IL-35的B细胞（IL-35+B cell, B35）为一群新型调节性B细胞，已有研究证明其在肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病中发挥重要作用。 【目的】 1. 建立BCG感染小鼠模型。 2. 检测IL-35亚基（P35和EBI3）在小鼠结核菌感染模型中不同感染时间点外周血及免疫组织中mRNA与蛋白表达量变化，丰富完善IL-35+Breg的相关研究。 3. 探究B35参与结核病的免疫调节机制，阐明其与小鼠结核菌感染疾病活动性及严重程度的相关性。 【方法】 1. 研究对象：无特定病原体（SPF 级）的C57BL/6J雌性小鼠，6-8周龄，体重14-16 g，小鼠处理过程和实验流程均遵循实验动物管理规范条例。 2 . BCG增殖培养：将冻存的分枝杆菌减毒株BCG接种到7H9液体培养基，置CO2培养箱，37℃，培养4-6周，取出菌液，介入新的液体培养基充分研磨， 2.0麦氏比浊管比浊分装。 3. BCG感染小鼠模型制备与验证：将BCG菌液经尾静脉注射C57BL/6J小鼠，生理盐水注射组作为对照组，小鼠感染后分别在2、4、8周摘眼球取血，无菌解剖分离获取小鼠肺组织、脾脏和骨髓冲洗液。肺组织计载菌量、制作石蜡包埋切片，进行小鼠肺组织病理学HE染色及抗酸染色，验证小鼠是否成功建模。 4 . BCG感染小鼠B细胞IL-35mRNA与蛋白表达的检测: 4.1.检测P35和EBI3mRNA相对表达：提取小鼠外周血及免疫组织总RNA，采用实时荧光定量PCR检测P35和EBI3 mRNA相对表达水平。 4.2.检测B细胞及产IL-35B细胞比例：自小鼠肺组织和脾脏分离的单个核细胞以及裂解红细胞后的外周血和骨髓冲洗液，用 B220-PerCP ， CD19-PE ， EBI3-APC CY7，P35-FITC抗体进行细胞抗原染色，上流式细胞仪进行检测，分析B220+CD19+P35+EBI3+B细胞比例。 4.3.产 IL-35B 细胞的分布情况：收集肺组织进行病理切片，采用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜分析小鼠肺组织B细胞中P35和EBI3蛋白分布。 【结果】 1. 小鼠一般情况变化：小鼠感染BCG后反应迟钝，体型瘦小，脾脏明显重于对照组（P<0.001），实验组肺HE染色可见肺泡结构紊乱、炎症细胞聚集等病变，抗酸染色示肺泡周围呈散在细长略带弯曲的红色杆菌，肺部载菌量在感染4周明显下降，至8周增加显著（P<0.001）。 2. 实时定量PCR检测结果显示：BCG感染小鼠外周血及免疫组织在不同感染时间点P35和EBI3 mRNA相对表达量显著高于对照组，各组织P35mRNA相对表达量高于EBI3，P35和EBI3 mRNA在外周血和肺组织的表达情况较一致。 3. 流式细胞术检测结果显示：BCG感染小鼠外周血及免疫组织不同感染时间点B细胞及产IL-35B细胞比例明显高于对照组，各组织B细胞占淋巴细胞比例约在（20-30）%，外周血和肺组织产IL-35B细胞占总B细胞比例在感染4周时显著增加，到第8周又有所减少。 4. 免疫荧光结合激光共聚焦显微镜检测结果显示：BCG感染小鼠肺组织B细胞高表达IL-35亚基（P35和EBI3）蛋白。 5. 相关性分析显示：感染小鼠外周血产IL-35B细胞比例与肺部载菌量存在负相关关系（R=-0.5674, P=0.0003），感染小鼠肺组织产IL-35B细胞比例与肺部载菌量存在负相关关系（R=-0.3679, P=0.0076）。 【结论】 1. 建立BCG感染C57BL/6小鼠模型。 2. BCG感染小鼠外周血及免疫组织中P35和EBI3 mRNA相对定量明显高于对照组，肺组织B细胞高表达IL-35亚基（P35和EBI3）蛋白。 3. BCG感染小鼠外周血及免疫组织中B细胞及产IL-35B细胞比例明显高于对照组，外周血及肺组织产IL-35B细胞比例分别与肺部载菌量存在负相关关系。