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目的:1.通过培养小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3细胞）,研究在不同氧糖剥夺（OGD）模型时间下,bEnd.3细胞的增殖情况并选择最优OGD时间;2.在最优OGD时间下,探究不同浓度活血定眩胶囊含药血清对bEnd.3细胞的保护作用及与细胞自噬的关系,并完善活血定眩胶囊治疗椎动脉型颈椎病的作用机理,为活血定眩胶囊的进一步临床推广应用奠定基础。方法:1.取生长状况良好的bEnd.3细胞,传代后分为5组,分别为正常对照组、OGD 3h组、OGD 6h组、OGD 9h组和OGD 12h组。先将其放在正常二氧化碳细胞培养箱中培养36h后,再按照上述分组将细胞进行OGD处理。OGD处理方法如下,首先将无糖DMEM培养基置于37℃,5%C02、94%N2、1%02及饱和湿度的三气细胞培养箱中低氧预处理30min。弃去各OGD组的旧培养基并置换成已低氧预处理的无糖DMEM培养基,然后将它们置于上述三气细胞培养箱中分别培养3h、6h、9h和12h。正常对照组即为OGD 0h组,因而在共培养36h后,将其培养液更换为无糖DMEM,并直接进行检测。运用普通光学显微镜观察bEnd.3的细胞形态并拍照,比较对照组与OGD各处理组中细胞形态的变化并使用CCK-8检测各组细胞活力。2.采用血清药理学理论方法制备活血定眩胶囊含药血清及空白血清。取生长状况良好的bEnd.3细胞,在同一代下分为7组,分别为模型对照组、不同浓度活血定眩胶囊含药血清OGD组（5%、10%、15%）、不同浓度空白血清OGD对照组（5%、10%、15%）,先将其放在正常的二氧化碳细胞培养箱中培养,待细胞增殖到80%-90%密度时,再将各组的基础培养基更换为无糖DMEM培养基,其次根据各组分组方式不同加入相应的血清,其中模型对照组中不放任何血清,并根据上一部分的结果,所得到OGD最佳时间,将各组放入三气细胞培养箱中共培养OGD最佳时间后取出,吸取细胞培养基上清液,采用比色法检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶（LDH）活性,采用硝酸根还原酶法检测一氧化氮（NO）;利用流式细胞仪检测细胞凋亡率,运用Western Blot法检测各组自噬指标LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、Beclin 1蛋白的表达,运用qPCR法检测各组P62及Beclin 1 mRNA的表达,综合以上结果分析活血定眩胶囊含药血清对bEnd.3细胞的保护作用及与细胞自噬的关系。结果:1.在光学显微镜下,正常对照组中bEnd.3细胞为长条状、梭型且分布规则,彼此相连,并呈丝网状有序排列,而在OGD模型组（3h、6h、9h及12h）中,随着时间的延长,bEnd.3细胞由原来的梭型逐渐往椭圆型发展,并在12h时,bEnd.3细胞大量死亡;通过CCK-8检测发现,与正常组比较,OGD模型组在4个时间点OD值均呈现下降趋势（P<0.05）,表明活随着时间的延长,bEnd.3细胞活力逐渐下降,并且结合光学显微镜结果,随着时间的推移,bEnd.3细胞凋亡率逐渐上升,且在OGD 12h时,细胞大量死亡。根据线性回归方程:y=-0.1186x+1.7375（R2=0.9881）可得,当活细胞占比为50%时,OGD诱导时间大约需要7.3小时,根据本实验结果,结合文献可得,在本实验中OGD诱导的最佳时间为6小时,确定6小时为OGD最佳时间。2.OGD诱导6小时后,与模型对照组相比,不同浓度含药血清组及不同浓度空白血清组均能在不同程度降低LDH的释放并增加细胞内NO分泌从而减轻由于OGD模型造成bEnd.3细胞损伤从,表明大鼠血清能够缓解细胞的损伤,并且降低细胞膜通透性;不同浓度空白血清组与不同浓度含药血清组相比,在相同剂量下,活血定眩胶囊含药血清均能显著抑制细胞上清液中LDH的增加,并增强NO的量从而保护细胞,10%、15%的活血定眩胶囊含药血清组差异显著（P<0.05）,其中10%含药血清组NO含量较其余各组最高,且差异显著（P<0.05）。在凋亡检测中,我们发现模型对照组中bEnd.3细胞凋亡为35.5%。5%、10%、15%含药血清组中bEnd.3细胞凋亡率分别为18.4%、5.7%、11.2%;而5%、10%、15%空白血清组中bEnd.3细胞凋亡率分别为25.7%、20.7%、15.3%。同等剂量的含药血清组和空白血清组相比,各含药血清能够较好的抑制OGD诱导的bEnd.3细胞的凋亡率,且与其他各组相比,10%含药血清组能够明显抑制bEnd.3细胞凋亡的进程。Western Blot的结果可知:（1）与模型对照组相比,5%、10%、15%的含药血清组及5%、10%空白血清组中P62/β-Actin相对表达量均明显下降（P<0.05）,而15%空白血清组P62/β-Actin相对含量较模型对照组升高（P<0.05）,而10%含药血清组中P62/β-Actin相对表达量比其余各组都低（P<0.05）;（2）在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的数据中我们可以发现,10%含药血清组较其他各组有明显升高（P<0.05）;5%、15%含药血清组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值较5%、15%空白血清组有所上升（P<0.05）;（3）在Beclin 1/β-actin中,10%含药血清蛋白相对表达量较其他各组有显著性的上升（P<0.05）,5%药血清组中Beclin 1/β-actin的相对含量小于5%空白血清组（P<0.05）,而在15%含药血清组中,其含量高于15%空白血清组（P<0.05）。qPCR结果表明:（1）含药血清组中Beclin 1 mRNA（BECN-1）的含量高于同等剂量的空白血清组;在P62mRNA中,空白血清组的表达量明显高于同等剂量含药血清组,（2）模型对照组中P62mRNA表达量降低而BECN-1的表达量上升。结论:1.在不同OGD时间诱导下,6小时为bEnd.3细胞最佳诱导时间2.活血定眩胶囊含药血清可显著对抗OGD诱导的bEnd.3细胞损伤,明显增强NO的含量,降低LDH的释放,减少bEnd.3细胞凋亡的数量,促进bEnd.3细胞增殖。3.活血定眩胶囊含药血清能够通过上调自噬相关蛋白Beclin 1、LC3及下调P62蛋白的表达,来减轻OGD诱导的bEnd.3细胞的损伤,从而调节血管内皮细胞的功能。