成年哺乳动物大脑可以产生新的神经元，这一发现是神经科学领域的重大突破。非常有趣的是这种脑结构可塑性的新模式仅发生在一些离散的脑区，目前大多数的研究者都把目光聚焦在脑室下区(subventricular zone，SVZ)和海马结构中的齿状回(dentate gyms，DG)。在过去的二十年问，该领域主要有两个研究方向：1)神经干细胞样细胞(和它们的子代细胞)的生物学特性和新生神经元如何整合到已存在的神经网络中；2)这些新生神经元在脑功能中的作用。方法学问题阻碍了这个领域的发展，但是也取得了相当大的进展。目前人们发现细胞内在机制和外在因子共同参与了成年神经再生的调节，而且环境和生理状况也可以影响神经再生，另外，神经再生也参与了一些脑疾病的病理过程。 目前人们大多使用BrdU来研究体内的神经再生。虽然用BrdU有很多优点，但是也存在不少缺点。因此，研究成年神经再生必须先从细胞(分子)水平开始，然后结合在体研究，从而提高研究结果的可靠性。而其中一个前提条件就是需要建立神经前体细胞的体外培养技术平台。 成年大鼠神经前体细胞的体外培养一直以来是一件比较棘手的事情。目前国际上培养成年神经前体细胞有两种方法：悬浮培养和贴壁培养。悬浮培养目前还存在争议，一部分学者认为悬浮生长的细胞克隆并非神经球。贴壁培养国际上仅Gage小组一家，同时也是目前被广为认可的培养方法。国内也一直没有实验室报导过用贴壁法培养成年大鼠的海马神经前体细胞。 L-型钙通道在神经发育过程中具有重要作用，并且有报道电压依赖性钙通道 参与了胚胎HPCs向神经元分化的调控。但在成年的HPCs上是否表达L-型钙通道目前尚未见报道。 本研究的目的是在参照Gages方法的基础上建立一种能够获得高纯度成年Wistar大鼠海马神经前体细胞(HPCs)的体外贴壁培养方法，并鉴定HPCs上是否存在功能性L-型钙通道。 本实验取Wistar成年雌性大鼠海马组织，制成单细胞悬液，利用无血清培养技术，在添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、N-2和B27supplement的DMEM/F12培养液中进行培养。在培养过程中我们发现，前三代细胞形态主要呈多角型有粗大突起，似星形胶质细胞，部分细胞呈圆形，有的呈分裂相。第四代时一种体积较小、呈圆形、周围长有细小突起的细胞逐步代替了原来的细胞。Alvarez-Buylla和Kaplan and Bell研究证实，成年哺乳动物海马存在两种神经前体细胞，一种细胞相当于SVZ中的B细胞，表达GFAP；另一种细胞由B细胞产生，体积较B细胞小，称为D细胞。以上表明我们体外培养的结果与上述报导是一致的。前四代细胞以B细胞为主，随着传代的进行B细胞逐渐生成了D细胞。采用细胞免疫荧光法对原代和第六代细胞分别进行鉴定，呈巢蛋白(Nestin)阳性的细胞分别达66.7％和99.9％。 在细胞培养液中加入5μmol/L的BrdU，作用24小时，BrdU与nestin免疫荧光双标发现几乎所有的细胞都同时表达这两种抗原，说明细胞处于活跃的分裂增殖期。 把培养的高纯度的细胞在分化培养基中诱导分化，分化第五天细胞就表现为神经元、星形胶质和少突胶质细胞的形态，分化第14天细胞免疫荧光分别呈Ⅲ型β-微管蛋白(Tujl)阳性和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性。细胞来源于成年神经组织的未分化细胞、具有自我复制能力、可分化为神经元和胶质细胞，表明所培养的细胞为神经前体细胞。 细胞免疫荧光和免疫印迹结果显示HPCs表达L-型钙通道的Cavl.2a<,1>C和Cavl.3a<,1>D亚单位。 共聚焦钙成像证明了HPCs上存在功能性L-型钙通道。首先我们在细胞外液中加入20mmol/L的KCl后，观察到荧光强度显著增强(F/FO=1.17±0.03，p<0.001，n=37)，表明去极化可诱导细胞内[Ca<2+>]<,i>增加。洗去KCl加入L-型钙通道特异性阻断剂Nifedipine(10μmol／L)，这时荧光强度略有降低(p<0.05)，稍后再加入KCl，同一视野相同细胞上未见荧光强度的显著增强(F／FO=1.03±0.02，p>0.05)。用Nifedipine的溶剂乙醇(1‰)处理HPCs，KCl仍可诱导荧光强度显著增强(F／FO=1.43±0.06，p<0.001，n=10)，表明Nifedipine的作用不是乙醇所致。另外，在无钙细胞外液中加入KCl后未见荧光强度的显著增强(F／FO=1.01±0.01，p>0.05，n=10)。以上结果表明L-型钙通道介导了KCl诱导的钙离子内流。(F／FO均为加入KCl后第80秒)。进一步我们用全细胞膜片钳技术记录到了L-型钙电流：当电压从-30 mV直接去极化到10 mV，平均电流为100 pA±2.35 pA；特异性的L-型钙通道激动剂BayK8644(1μmol／L)使该电流显著增加至150 pA±15.15 pA(n＝3)，与正常对照组比，差异显著(P<0.05)；而1 μmol／L的特异性阻断剂尼氟地平(Nifedipine)可明显使该电流降低到正常对照组的65％左右(P<0.05)，10μmol／L尼氟地平几乎完全抑制了该电流。 以上结果表明成年Wistar大鼠HPCs表达功能性的L-型钙通道。