兔卵母细胞体外成熟、孤雌激活及激活胚胎的培养

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本试验对影响兔的超数排卵的因素、卵母细胞体外成熟体系、卵母细胞的孤雌激活以及孤雌激活胚胎的体外培养四个方面进行了研究,从而优化兔卵母细胞体外培养、孤雌激活以及孤雌胚胎培养的体系,建立卵母细胞体外发育的技术平台,为兔卵母细胞发育和孤雌生殖相关机理的研究奠定基础。得到如下结果:1、研究影响兔超数排卵的月龄、激素剂量、季节这三个因素。结果表明,分别对4、6、8、12月龄的母兔进行超排,其获得的平均排卵数的差异不显著(P>0.05),本试验选择4月龄母兔进行超数排卵。采用PMSG+hCG组合对4月龄母兔超排处理,80IU PMSG获得的平均卵母细胞数显著高于60IU和100IU(P<0.05)。春季对兔子进行超排的排卵数显著高于其他三个季节(P<0.05),达(94.7±2.51)枚,且春季对卵母细胞体外成熟率和孤雌激活率均显著高于夏季和冬季(P<0.05),秋季次之,但差异不显著。2、研究不同类型卵母细胞和添加不同浓度的PMSG的体外培养体系对兔卵母细胞体外成熟的影响,结果表明,4种不同类型卵母细胞体外成熟培养,A级和B级卵母细胞的成熟率较高(P<0.05)。在成熟液中添加不同浓度(0,0.5,1,1.5,2IU/mL)的PMSG对兔卵母细胞进行体外成熟培养,其中1IU/mL PMSG组卵母细胞成熟率显著高于其他各处理组(P<0.05),达70.08%。3、研究不同激活方案对成熟卵母细胞的孤雌激活的影响。结果表明:卵母细胞经离子霉素作用5min或者乙醇作用7min均能被激活,其中离子霉素处理组卵裂率高于乙醇处理组,但是二者之间囊胚率都较低,差异不显著(P>0.05)。离子霉素+6-DMAP处理组卵裂率显著高于乙醇+6-DMAP处理组(P<0.05)。与离子霉素联合激活,2.0mmol/L的6-DMAP处理5.0h时的卵裂率和囊胚率最高,达75.6%和45.5%。4、比较不同培养基和培养方法对孤雌胚胎体外培养的影响。结果表明,采用三种不同培养基(M-199,DMEM和卵裂液)对兔孤雌胚胎进行体外培养,卵裂液培养基中卵裂率和囊胚率均显著高于其他两组(P<0.05);在卵裂液培养基中添加0.1%巯基乙醇,孤雌胚胎的卵裂率显著提高(P<0.05),但囊胚率较低(P<0.05);将孤雌胚胎置于添加0.1%巯基乙醇的卵裂液培养基中培养12h,然后转入卵裂液培养基中,隔天换液培养,其卵裂率和囊胚率显著提高,达(89.55%,47.58%)。
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