【摘 要】
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目的:1.构建大鼠DGKγ-shRNA慢病毒表达载体;2.探究甘油二酯激酶γ(DGKγ)对神经干细胞(NSCs)增殖、迁移的影响。方法:1.同源重组法构建大鼠DGKγ-shRNA慢病毒表达载体,包装产生慢病毒并感染原代培养的大鼠NSCs,RT-qPCR和Western blotting法检测大鼠NSCs内DGKγmRNA和蛋白的表达。2.CCK-8法和神经球计数检测感染DGKγ-shRNA、PKC
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目的:1.构建大鼠DGKγ-shRNA慢病毒表达载体;2.探究甘油二酯激酶γ(DGKγ)对神经干细胞(NSCs)增殖、迁移的影响。方法:1.同源重组法构建大鼠DGKγ-shRNA慢病毒表达载体,包装产生慢病毒并感染原代培养的大鼠NSCs,RT-qPCR和Western blotting法检测大鼠NSCs内DGKγmRNA和蛋白的表达。2.CCK-8法和神经球计数检测感染DGKγ-shRNA、PKC激动剂PMA和DGK抑制剂R59949处理后NSCs的增殖情况,并显微测量各组NSCs的迁移距离。结果:1.大鼠DGKγ-shRNA慢病毒表达载体构建及鉴定:慢病毒感染NSCs 48h后镜下观察,DGKγ-shRNA组和Scramble组NSCs均有效感染慢病毒,发出绿色荧光。RT-qPCR和Western blotting结果显示,DGKγ-shRNA组DGKγmRNA和蛋白表达显著低于Scramble组(均P<0.001)。2.DGKγ-shRNA对NSCs的增殖影响:CCK-8法检测结果显示,shRNA干扰导致的NSCs内DGKγ低表达,细胞增殖能力显著降低(P<0.05);DGK抑制剂R59949对NSCs的增殖能力也显著抑制(P<0.05);但PKC激动剂PMA有显著的促NSCs增殖作用(24h,P<0.05;48h、72h,P<0.001)。神经球计数结果显示:DGKγ低表达和R59949对直径在50~100μm的神经球形成有显著的抑制作用(P<0.001),而PMA有显著的促进作用(P<0.05)。3.显微测量结果显示:DGKγ低表达、R59949和PMA均抑制NSCs的迁移(均P<0.001),PMA组NSCs的迁移距离最短,并且显著低于R59949组(P<0.05)。结论:成功构建了DGKγ-shRNA慢病毒表达载体,并下调了DGKγ在NSCs的表达;DGKγ的低表达可以抑制NSCs的增殖和迁移,DGKγ促增殖未通过PKC途径,促迁移可能与PKC途径有关。
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