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奶牛乳腺炎主要由病原微生物感染引起,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是最常见的致病菌之一。S.aureus能够侵入多种哺乳动物细胞并在其中存活,这一特性使得S.aureus能够逃避免疫系统的清除,并造成慢性感染。因此,进一步阐明S.aureus在乳腺内持续感染的机制将有助于该病的防控。研究发现,病原微生物能够通过调控线粒体自噬影响先天免疫反应,从而逃避免疫系统的清除。目前,线粒体自噬在S.aureus感染奶牛乳腺中的作用机制未见报道。本研究使用奶牛乳腺上皮细胞建立S.aureus胞内感染模型,采用流式细胞术、免疫荧光技术和蛋白免疫印迹等方法探究线粒体自噬在S.aureus感染奶牛乳腺上皮细胞中的作用及潜在的分子机制,为临床该病的预防和治疗提供科学理论依据。1.金黄色葡萄球菌感染对奶牛乳腺上皮细胞线粒体自噬的影响本研究使用MAC-T细胞和S.aureus临床分离株建立胞内感染模型,采用流式细胞术、免疫荧光技术、Western blotting和透射电子显微镜等方法,检测S.aureus感染对奶牛乳腺上皮细胞线粒体自噬的影响。结果显示,S.aureus胞内感染造成细胞中ROS水平极显著升高（p＜0.01）,线粒体膜电位显著或极显著下降（p＜0.05或p＜0.01）,线粒体丝状结构被破坏。在S.aureus感染的细胞中线粒体和自噬体共定位显著增多（p＜0.01）,同时线粒体与溶酶体也发生明显的共定位,损伤的线粒体被自噬溶酶体包裹。在S.aureus胞内感染后,LC3Ⅱ的表达极显著升高（p＜0.01）;线粒体外膜蛋白TOM20和内膜蛋白TIM23的蛋白水平显著或极显著下降（p＜0.05或p＜0.01）;mtDNA拷贝数显著或极显著减少（p＜0.05或p＜0.01）。为进一步证明线粒体通过溶酶体途径降解,使用氯喹抑制溶酶体的降解功能后,能显著或极显著抑制S.aureus诱导的TOM20和TIM23的降解（p＜0.05或p＜0.01）。以上结果表明,S.aureus内化进入MAC-T细胞后造成线粒体损伤,诱导奶牛乳腺上皮细胞线粒体自噬。2.基于Pink1/Parkin探究线粒体自噬在S.aureus感染奶牛乳腺上皮细胞中的作用通过干扰RNA技术和慢病毒转染技术,分别建立了 Pink1沉默和过表达的细胞模型,采用Western blotting和免疫荧光技术检测Pink1/Parkin途径对S.aureus诱导MAC-T细胞线粒体自噬的影响。结果显示,S.aureus感染细胞后,Pink1的蛋白水平显著升高（p＜0.05）,Parkin的蛋白水平无显著性变化。对线粒体蛋白分析发现,S.aureus感染细胞后,线粒体蛋白中Pink1的蛋白水平极显著升高（p＜0.01）,Parkin的蛋白水平显著升高（p＜0.05）。干扰Pink1能显著抑制S.aureus诱导的TOM20和TIM23的降解（p＜0.05）,极显著抑制线粒体和自噬体的共定位（p＜0.01）。过表达Pink1能显著或极显著增强S.aureus诱导的TOM20和TIM23的降解（p＜0.05或p＜0.01）,极显著促进线粒体和自噬体的共定位（p＜0.01）。以上结果表明,Pink1/Parkin途径在S.aureus诱导MAC-T细胞线粒体自噬中发挥重要作用。3.Pink1/Parkin介导的线粒体自噬对S.aureus诱导奶牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性小体和NF-κB信号通路的影响通过Western blotting检测NLRP3炎性小体活性和NF-κB信号通路相关蛋白,探究Pink1/Parkin介导的线粒体自噬对S.aureus诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的影响。结果显示,S.aureus感染MAC-T细胞后,NLRP3、Caspase-1 p20和IL-1βp17的蛋白表达水平显著或极显著升高（p＜0.05或p＜0.01）,p65和IκBα的磷酸化水平显著或极显著升高（p＜0.05或p＜0.01）。与单独S.aureus感染相比,Mdivi-1预处理能显著或极显著增强S.aureus诱导的NLRP3,Caspase-1 p20和IL-1β p17蛋白的表达水平（p＜0.05或p＜0.01）,同时显著增强p65和IκBα蛋白的磷酸化水平（p＜0.05）。与对照组（NC）相比,S.aureus感染后细胞中NLRP3,Caspase-1 p20和IL-1β p17的蛋白水平显著升高（p＜0.05）,p65和IκBα的磷酸化水平显著或极显著升高（p＜0.05或p＜0.01）,干扰Pink1能显著或极显著增强S.aureus诱导的上述蛋白水平的变化（p＜0.05或p＜0.01）。过表达Pink1能显著或极显著抑制S.aureus诱导的NLRP3,Caspase-1 p20和IL-1β p17蛋白表达水平（p＜0.05或p＜0.01）,同时极显著降低p65和IκBα的磷酸化水平（p＜0.01）。以上结果表明,Pink1/Parkin介导的线粒体自噬能抑制S.aureus诱导的NLRP3炎性小体活性和NF-κB信号通路激活。4.mtROS在S.aureus诱导MAC-T细胞炎性反应中的作用研究为了探讨mtROS在S.aureus诱导MAC-T细胞炎性反应中的作用,分别采用流式细胞术和Western blotting检测细胞mtROS水平和NLRP3炎性小体及NF-κB信号通路相关蛋白的变化。通过测定S.aureus 的细菌载量,探究 Pink1/Parkin介导的线粒体自噬对S.aureus胞内存活的影响。结果显示,干扰Pink1极显著增强S.aureus诱导的mtROS产生（p＜0.01）,过表达Pink1极显著抑制S.aureus诱导的 mtROS 产生（p＜0.01）。Western blotting 结果显示,与 NC+S.aureus 组相比,干扰Pink1能显著或极显著增强S.aureus诱导的NLRP3、Caspase-1 p20和IL-1βp17蛋白表达水平（p＜0.05或p＜0.01）,同时显著或极显著提高p65和IκBα的磷酸化水平（p＜0.05 或 p＜0.01）。与 siPink1+S.aureus 组相比,在 siPink1+S.aureus+MitoTEMPO 组中,NLRP3、Caspase-1 p20 和 IL-1β p17 蛋白表达水平以及p65和IκBα蛋白的磷酸化水平极显著降低（p＜0.01）。与对照组比,Mdivi-1或干扰Pink1极显著降低细胞中S.aureus的细菌载量（p＜0.01）,过表达Pink1极显著增加细胞中S.aureus的细菌载量（p＜0.01）。以上结果表明,通过减少细胞中mtROS产生,Pink1/Parkin介导的线粒体自噬能抑制S.aureus诱的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应。同时,S.aureus能够利用Pink1/Parkin介导的线粒体自噬促进其在奶牛乳腺上皮细胞中存活。综上所述,S.aureus内化进入奶牛乳腺上皮细胞后造成线粒体损伤,诱导Pink1/Parkin介导的线粒体自噬;Pink1/Parkin介导的线粒体自噬抑制S.aureus诱导的NLRP3炎性小体活性和NF-κB信号通路激活与减少mtROS的产生有关。S.aureus可利用线粒体自噬促进其在奶牛乳腺上皮细胞中的存活。