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研究背景癌症是当今全球医学界面临的一个重大难题,每年约造成800万人死亡。目前常规的治疗手段包括化疗、放疗与手术治疗,虽提高了多种肿瘤的治愈率、延长了癌症患者的生存期,但也存在诸如副作用强、肿瘤耐药性等种种弊端,寻求新的肿瘤治疗方法变得愈发迫切。TDP-43作为一种高度保守的DNA/RNA调节蛋白,存在于几乎所有组织器官中,具有相当广泛的作用范围,近年来有关TDP-43相关研究主要集中于神经退行性疾病之中。研究人员发现病理状态的TDP-43会导致细胞毒性,诱导细胞凋亡,对神经元和胶质细胞等正常细胞产生抑制或杀伤作用,然而其在肿瘤细胞中的作用知之甚少。因此,本研究以TDP-43蛋白为切入点,探求其在肿瘤细胞凋亡过程中的作用机制,并研究两种中药提取物诱导肿瘤细胞凋亡过程与TDP-43之间的关系。研究目的研究肿瘤细胞凋亡过程中TDP-43含量的变化及其调节因素;研究TDP-43在肿瘤细胞凋亡过程中的代谢情况,以及代谢产物对肿瘤细胞存活的影响;研究中药提取物诱导凋亡时肿瘤细胞内TDP-43含量的变化情况。研究方法本研究分为四个部分:第一部分我们首先通过Western blot检测人脑胶质瘤细胞U87凋亡时TDP-43含量的变化,并通过qRT-PCR与加入抑制剂的方法研究其原因,进而研究TDP-43含量对于肿瘤细胞活力的影响;第二部分我们通过在两种乳腺癌细胞(MCF7-vec和MCF7-C3)上的对比研究进一步确定诱导凋亡的肿瘤细胞内TDP-43含量下降的原因,及其代谢产物(35KD CTF和35KDNC)的不同机制,研究两种代谢产物的降解机制,并且研究35kDCTF对于乳腺癌细胞存活的影响;第三部分我们重点研究MCF7-vec细胞中TDP-43代谢的机制,通过RNAi技术、Westemblot以及免疫沉淀等手段研究35kD NC片段的序列;第四部分我们研究原人参二醇(aPPD)和三七总皂苷(PNS)两种中药提取物诱导肿瘤细胞凋亡过程中对TDP-43含量的影响。实验结果一.在人脑胶质瘤细胞U87中,STS诱导凋亡时TDP-43含量下降,其原因包括转录水平降低以及caspase3的激活,而且TDP-43含量下降能够增强STS对U87的细胞毒性作用;二.在人乳腺癌细胞MCF7-vec和MCF7-C3中,STS与TAM诱导细胞凋亡时均能够导致TDP-43含量的减少,然而其原因却不相同。在MCF7-C3中,TDP-43主要是被激活的caspase3切割产生35KDCTF;在MCF7-vec中,TDP-43则是被另外某种蛋白酶切割,产生35kDNC。两种35kD片段均具有细胞毒性,且都是通过泛素-蛋白酶体系统而降解。过表达TDP-43以及35kDCTF会明显抑制MCF7-C3、MDA、BT474三种乳腺癌细胞的存活,也会增强TAM对MCF7-vec细胞的毒性;三.敲除caspase6会增强MCF7-vec和MCF7-C3中STS与TAM诱导凋亡细胞内TDP-43含量的减少,说明在MCF7-vec细胞中切割TDP-43的未知蛋白酶X可以被STS和TAM诱导激活,而且可能是caspase6的底物。Western blot与IP结果显示MCF7-vec中产生的35kD片段是N末端片段;四.原人参二醇能够诱导人胶质瘤细胞U87细胞发生凋亡,其TDP-43含量发生减少;三七总皂苷对于人胃癌细胞BGC823活力的作用则呈现随浓度升高先促进后抑制的趋势,高浓度时亦会导致TDP-43含量减少。结论一.TDP-43在多种肿瘤细胞凋亡过程中发挥重要作用;二.TDP-43含量减少或者被切割产生的35kD片段堆积都会产生细胞毒性,导致肿瘤细胞凋亡;三.中药提取物aPPD和PNS诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制亦可能与TDP-43有关。