大鼠听觉剥夺后BcL-2、Bax、Fas在听皮层的表达变化及脑苷肌肽注射液对其变化的影响

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目的:通过双侧耳蜗损毁术建立听觉剥夺(Auditory Deprivation,AD)动物模型,研究SD大鼠在听觉剥夺后Bcl-2、Bax、Fas在听皮层的表达,以及脑苷肌肽注射液对Bcl-2、Bax、Fas表达变化的影响,了解听觉剥夺后听觉中枢可塑性变化以及脑苷肌肽注射液的作用,为听力障碍患者的辅助治疗提供动物实验资料。  方法:  1、选择耳廓反射灵敏、无中耳疾患、生后3周龄的雄性清洁级健康SD大鼠,共64只,将其至于适宜的温、湿度环境中饲养。按体重将其随机分为8组(8只/组):7天对照组,7天手术组,14天对照组,14天手术组,14天治疗组,28天对照组,28天手术组,28天治疗组。手术组大鼠实施双侧耳蜗损毁术,对照组大鼠只做耳后切口,治疗组大鼠实施双侧耳蜗损毁术并每日腹腔注射脑苷肌肽注射液,剂量1 ml/kg,连续14或28天。  2、术后7天对各组大鼠进行听性脑干反应(ABR)测试,然后在相同条件下饲养各组动物至对应的时间点后,每组随机取4只大鼠的双侧大脑听皮层做HE染色和免疫组化检测,其余4只取听皮层做实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测。  3、用HE染色的方法观察大鼠听皮层部位形态学变化。  4、采用免疫组织化学方法测定大鼠听皮层部位Bcl-2、Bax、Fas的表达,然后在光镜下对棕色颗粒阳性细胞数目进行统计。  5、采用RT-PCR技术检测大鼠听皮层部位Bcl-2、Bax、Fas基因mRNA的表达。  6、采用Western Blot技术检测大鼠听皮层部位Bcl-2、Bax、Fas蛋白的表达变化。  结果:  1、ABR测试情况:对照组SD大鼠经ABR测试在40SPL dB时出现重复波形,耳蜗损毁手术大鼠术后7天双耳在90 SPL dB均不能引出重复波形,证明听觉剥夺动物模型制作成功。  2、术后一般情况:术后第二天听觉剥夺大鼠即能自主饮水摄食,爬行沿直线,拎尾悬空能保持平衡,但是与对照组相比行动仍显迟缓。听觉剥夺大鼠对外界声音刺激不敏感,耳廓反射消失,而对照组耳廓反应灵敏。  3、HE染色结果:手术组和治疗组均出现不等量的凋亡细胞,体积缩小,颜色深染,胞浆着色浅淡,核固缩,染色质凝集断裂,核仁消失。治疗组与相应的手术组相比,细胞凋亡现象减轻,胞浆红染程度减轻,细胞核,染色质聚集减少。实验结果表明大鼠在听觉剥夺后听皮层出现凋亡现象,脑苷肌肽注射液可以减轻凋亡的程度。  4、免疫组化结果:各组各个时间点均有Bcl-2、Bax、Fas阳性细胞。手术组Bcl-2阳性细胞数明显低于相应的对照组,治疗组Bcl-2阳性细胞数显著多于相应的手术组。而手术组Bax和Fas阳性细胞数显著高于相应的对照组,治疗组阳性细胞数显著少于相应的手术组。实验结果表明听觉剥夺后大鼠听皮层表达促凋亡基因Bax和Fas的细胞增多,表达抑凋亡基因Bcl-2的细胞减少,而脑苷肌肽注射液可以阻止这些变化。  5、蛋白免疫印迹检测结果:手术组Bcl-2蛋白灰度比值显著低于相应的对照组,治疗组灰度比值显著高于相应的手术组。而手术组Bax、Fas蛋白灰度比值显著高于相应的对照组,治疗组灰度比值显著低于相应的手术组。实验结果表明听觉剥夺后大鼠听皮层促凋亡基因蛋白Bax和Fas表达升高,抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低,而脑苷肌肽注射液可以减轻这些变化的程度。  6、RT-PCR检测结果:手术组Bcl-2基因mRNA的表达显著低于相应的对照组,治疗组基因表达比相应的手术组显著增强。而手术组Bax和Fas基因mRNA的表达显著高于相应的对照组,治疗组基因表达与相应的手术组比较显著减弱。实验结果表明听觉剥夺后大鼠听皮层促凋亡基因Bax和Fas的表达增强,抑凋亡基因Bcl-2的表达减弱,而脑苷肌肽注射液可以阻止这些变化。  结论:  1、双侧耳蜗损毁术能够建立稳定性强的听觉剥夺动物模型。  2、 Bcl-2、Bax、Fas这三个基因在大鼠的听皮层均有表达。  3、Bcl-2、Bax、Fas参与了听觉剥夺后听皮层神经元凋亡的过程。  4、脑苷肌肽注射液通过抑制细胞凋亡的途径实现对听觉剥夺所致听觉中枢损伤的保护作用。
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