论文部分内容阅读
1995年发现的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL),是肿瘤坏死因子超家族成员之一,属于Ⅱ型跨膜蛋白。人TRAIL由281aa组成,其编码序列有843bp。C端41～281aa为胞外区,可经半胱氨酸蛋白酶水解为只含有C端114～281aa的可溶性TRAIL114～281;但在体内并未发现该可溶性分子被酶从膜上切下。TRAIL通过特异性的死亡受体(TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5)来诱导凋亡。膜结合型TRAIL和TRAIL114～281在体外均能诱导多种肿瘤细胞的凋亡TRAIL通过一个Zn2+与3个配体亚单位中第230位的半胱氨酸螯合,形成头尾相接的钟形三聚体,而这种同源三聚体的形式则是TRAIL和受体相结合时,发挥活性的功能模式由于TRAIL114～281拥有较广的抗瘤谱,且对正常组织细胞几乎无毒性,近年来作为新型抗肿瘤药物走入临床应用,并已显示出良好的肿瘤杀伤效果。但是,由于体现抗肿瘤活性的TRAIL三聚体是由三段单体仅仅通过Zn2+络合而成,因此结构较为松散,不是很稳定,在使用时易降解而降低抗肿瘤的效果。Anja Krippner-Heidenreich等成功地将三聚体TNF的三个单体以柔性肽链(GGGS) 3或(GGGS) 4连接成单链化的TNF(scTNF)。单链化后的scTNF仍然保持原先的三聚体结构,且稳定性增强,毒性减小,抗肿瘤活性略有增强。本研究中,我们尝试将人TRAIL114～281三聚体的三个单体的氨基酸片段以两段柔性氨基酸短臂(GGGS)3,头尾相连,使之融合成为一条多肽链scTRAIL即: TRAIL114～281-(GGGS)3-TRAIL114～281-(GGGS)3-TRAIL114～281,以增强抗肿瘤的效果。通过PCR和限制性内切酶酶切、连接技术,获得编码单链化蛋白scTRAIL的基因序列,构建了含编码人scTRAIL基因的重组质粒,在宿主菌E.coli BL21中得到了较高水平的表达,并用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱对表达产物进行了初步纯化,获得了融合了麦芽糖结合蛋白标签的可溶性重组蛋白MBP-scTRAIL。最后,对MBP-scTRAIL的生物学活性进行初步研究。以pBV220-TRAIL114～281为模板,设计三对引物,采用PCR技术扩增三段修饰后的TRAIL114～281单体编码序列T1、T2和T3,使得每段单体上附带一小段柔性氨基酸链接臂的编码序列；再利用PCR技术扩增获得T23；以pMAL-C2x为载体,利用酶切连接技术构建重组质粒pMAL-T1和pMAL-T23;最后,以pMAL-T23为载体质,粒,T1为目的片段,构建重组质粒pMAL-T123。至此,获得重组蛋白scTRAIL的基因编码序列。以E.coli BL21为表达宿主菌,用测序正确的重组质粒pMAL-T123进行转化,选取阳性克隆菌落用LB液体培养基培养,IPTG诱导表达重组蛋白MBP-scTRAIL,并用MBP亲和层析柱纯化。经SDS-PAGE和免疫印迹验证,在预期分子量(约110KD)的位置可见明显蛋白条带。第二部分scTRAIL生物学活性研究用体外药物实验验证重组蛋白的诱导凋亡活性。体外培养正常细胞(人脐静脉内皮细胞HUVEC)和两种不同来源的肿瘤细胞(大细胞肺癌细胞NCI-H460和人胰腺胆管上皮细胞SW1990),分不给药的空白对照组、加MBP-scTRAIL组、MBP-TRAIL114～281组和MBP组,加蛋白药物组对比对照组,计算抑制率,评价重组蛋白的生物学活性。通过急毒试验检测重组蛋白的急性毒性。用ICR小鼠作为实验动物,腹腔注射MBP-scTRAIL溶液,连续观察14天,统计小鼠的死亡率,观察存活小鼠的形态、行为变化,评价该重组蛋白作为体内用药的急毒安全性。实验结果：编码scTRAIL的基因序列得以成功地构建并克隆,重组蛋白在原核表达系统中较高效表达并能被MBP亲和层析柱分离纯化。体外细胞实验证明,MBP-scTRAIL具有很强的的抗肿瘤活性,且明显高于MBP-TRAIL114～281;在动物急毒试验中,MBP-scTRAIL在较高的腹腔注射剂量(75mg/kg)仍未对实验动物表现急性毒性,对正常机体组织无损伤.预示着该蛋白在肿瘤临床治疗上具有良好的应用前景。