背景毛囊是控制毛发生长的皮肤附属器官,在哺乳动物出生后的生命过程中,毛囊反复经历着生长期(anagen)、退行期(catagen)和静止期(telogen)的循环,通过周期性的生长,毛囊展示出充分的自我更新和再生能力。诸多因素可影响毛囊的周期性循环而导致秃发。秃发性疾病如雄激素性秀发、斑秃等虽然不属于严重疾病,但却给大多数患者造成了严重的心理压力,可影响患者的生活及社交活动。临床上以雄激素性秃发患者最为常见。目前,治疗雄激素性秃发的方法主要包括：一是药物治疗,即采用米诺地尔和非那雄胺,但其仅能暂时延缓脱发进程；二是手术治疗,即自体毛发移植术,但其也仅是将头部非秃发区的毛囊移植至秃发区以实现毛囊的重新分布,并未增加实际的毛发数量,而且对于大面积秃发者还存在着供区毛囊数量不足的缺陷。此外,供区存在瘢痕、移植成活率不稳定和手术效率低等问题也使手术效果受到明显影响。近年来,随着组织工程及再生医学的发展,通过组织工程技术重建毛囊逐渐成为治疗大面积秃发的理想选择。构建组织工程毛囊的前提条件是获得充足的且具备生物学功能的种子细胞。毛囊由表皮成分和真皮成分两部分组成,表皮和真皮间的相互作用决定了毛囊正常的形态发生、周期性循环和重建再生的过程。表皮成分包括毛囊干细胞、毛母质、内外根鞘,而真皮成分则包括毛乳头(dermal papilla, DP)和结缔组织鞘。其中,毛乳头细胞(dermal papilla cell, DPC)对毛囊的形态发生、周期性循环和诱导重建中起到关键作用。人体内正常的DPC呈聚集性生长,细胞间高度紧密连接形成直径为150-250 u m的乳头状三维结构。在体外常规的二维(2D)培养条件下,尽管DPC依然保留自身特有的一些生物学特性和功能,包括呈聚集性生长的细胞行为,表达多种特异性的细胞标记物和具有诱导毛囊再生的能力。但是随着传代次数的增加,体外培养的DPC会逐渐丧失上述的生物学特性和功能。目前我们尚不清楚高传代的DPC其生物学特性和生物学功能逐渐丧失的具体原因。因此,如何在体外培养条件下使DPC在传代扩增后仍具备生物学特性和功能,是重建人组织工程毛囊的关键。主流的研究表明：三维培养体系有助于在体外建立细胞培养的仿生微环境。其中,悬滴(hanging drop, HD)培养是较为常用而简便的方法。近年来出现了将传统悬滴培养结合高通量技术的微阵列悬滴培养板(hanging drop plates, HDP),这一革新的三维培养平台在构建体外细胞的三维培养模型及微组织上具有明显的优势。因此,我们认为通过建立高传代人DPC的体外三维悬滴培养模型,进而构建出仿生的DPC微组织,不仅有助于系统地研究DPC的生物学特性和功能,也能为重建人组织工程毛囊提供充足且具有生物学功能的种子细胞。目的1.构建高传代人毛乳头细胞的体外三维悬滴培养模型,通过该三维培养模型构建出高传代人毛乳头细胞的仿生三维微组织2.对高传代人毛乳头细胞体外三维悬滴培养模型进行相关的检测和评价3.应用高传代人毛乳头细胞仿生三维微组织进行体内移植后的毛囊诱导重建方法1.高传代人毛乳头细胞三维悬滴培养模型的构建采用酶消化结合显微解剖法对DPC进行分离和培养,观察DP的形态、贴壁及细胞迁出情况；观察P1-P10各代数DPC的形态学及生长方式变化；通过CCK-8实验检测P1-P10各个代数DPC的增殖活性；利用免疫荧光染色观察DPC相对特异性分子标记物ALP、α-SMA的情况。将培养的第3代DPC分为4组,根据正常毛乳头的直径范围(150-250μm),分别以1×104/40ul/孔、0.5×104/40ul/孔、0.25×104/40ul/孔、0.1×104/40ul/孔的低细胞密度进行接种,每组各接种30个孔,镜下观察并拍照记录各组构建的DPC微组织的形态,并对各组DPC微组织的直径范围和数量进行统计分析,筛选出三维悬滴培养模型的最佳细胞接种密度。根据筛选出的最佳细胞密度进行接种培养14天,分别在第0、1、4、7、10和14天的不同时间点,于镜下观察悬滴中DPC的聚集程度及微组织形态的变化情况；分别于培养的第7、10和14天取材微组织进行活死染色,以评价微组织内细胞的存活情况；综合上述结果筛选出三维悬滴培养模型的最佳培养时间。分别取培养的第2代和第8代DPC制成细胞悬液,细胞浓度均调整为6.25×104/ml,将两组DPC分别以前述实验筛选优化出的最佳接种及培养条件随机接种于悬滴培养板中培养,镜下观察对比低传代和高传代DPC的生长方式及微组织构建情况,对两组构建出的正常DP直径范围内的微组织百分比进行分析。2.高传代人毛乳头细胞三维悬滴培养模型的检测和评价取第8代DPC构建的微组织,采集后用4%多聚甲醛溶液固定,进行常规组织切片的H&E染色、增殖标记物Ki67和凋亡坏死标记物TUNEL的免疫荧光染色；体外再接种培养：将收集到的DPC微组织,使用200μl枪头以注射的方式模拟移植至新培养皿内进行再接种培养,待其自然贴壁并有细胞迁出后,光镜下于接种后第1、3、7天定期观察并拍照记录其自然贴壁和细胞迁出情况,取微组织和迁出细胞的样本进行扫描电镜观察,并与正常人DP接种培养后的情况进行对比。取第2代DPC进行常规二维培养,第8代DPC分别进行二维培养和三维悬滴培养,以及第3代头皮皮肤真皮成纤维细胞(dermal fibroblast, DF)进行三维悬滴培养,检测各组中DPC标记物的生物学特性：采用qRT-PCR检测ALP、 a-SMA和NCAM的基因表达水平；采用免疫荧光染色定性检测ALP、α-SMA和NCAM的蛋白表达情况；采用免疫印迹法定量检测ALP、α-SMA和NCAM的蛋白表达水平。3.高传代人毛乳头细胞三维微组织移植后的体内毛囊重建取第8代人DPC先用CM-Dil进行活体荧光染色标记,以最佳接种培养条件进行三维微组织的构建；同时,采用酶消化分离获得新生鼠皮肤的表皮细胞(epidermal cells,EPC),按以下分组进行细胞及微组织的注射移植以重建毛囊：(1)表皮细胞1×106个；(2)表皮细胞1×106个+P8-DPC 1×106个；(3)表皮细胞1×106个+P8-DPC微组织60个；于移植后3-4周对移植部位进行组织取材,对移植物进行大体观察、组织切片H&E染色和荧光镜检。结果1.高传代人毛乳头细胞三维悬滴培养模型的构建采用酶消化结合显微解剖法获得的DP形态完整,呈梨形或卵圆形,接种后可自然贴壁并有细胞迁出；迁出的DPC呈长梭形或不规则多边形,围绕DP组织呈放射状生长团聚；当第1代～第6代的人DPC培养达到融合性生长后,可表现出特有的聚集性生长行为,呈现漩涡状的细胞图案；培养至第6代以后,DPC的漩涡状和聚集性生长特性则变得不甚明显。培养的DPC体积较成纤维细胞略大,小于4代的低传代细胞甚至可观察到球形多细胞聚集体；DPC的聚集性生长随着传代次数的增加而逐渐丧失；至第4代时聚集的细胞团数量已明显减少,第6代以后基本无聚集性生长现象。P1-P10各代数DPC的增殖活性随着培养时间的延长,总体呈一逐渐增加的趋势；但是P1-P10各代数DPC随着细胞传代代数的增加,其增殖活力则逐渐下降。酶消化结合显微解剖法分离培养获得的DPC,其ALP和α-SMA的表达均为阳性。以1.0×104/40ul/孔、0.5×104/40ul/孔、0.25×104/40ul/孔和0.1×104/40ul/孔的不同细胞密度接种于三维悬滴板内培养7d,结果表明在0.25×104／孔组中形成的介于正常DP直径范围(150-250μm)内的微组织数量最多。DPC以最佳细胞接种密度即0.25×104/孔接种后,当培养至7d时形成的微组织较稳定、形态最好,且微组织内的细胞存活情况最佳。低传代(P2)和高传代(P8)两组DPC分别以最佳细胞接种密度0.25×104/孔接种培养7d后,其形成正常DP直径范围内的微组织在数量上无明显差别,表明三维悬滴培养模型可用于构建高传代人DPC三维微组织。2.高传代人毛乳头细胞三维悬滴培养模型的检测和评价DPC与DF培养情况对比：DPC外观上呈较宽大的长梭形或不规则多边形,可见聚集性生长行为,呈现漩涡状图案；而DF为细长梭形,较DPC体积小,没有聚集性生长行为,呈现编织状图案。微组织的组织学特点：第8代DPC微组织结构较完整规则,细胞排列均匀,细胞间充斥着大量细胞外基质成分,类似于正常的DP组织。微组织的免疫组化特点：第8代DPC微组织内的细胞总体呈现出相对低增殖和低凋亡坏死的状态；经分析约有5.2%的细胞发生增殖,仅有5.93%细胞发生凋亡坏死。第8代DPC微组织具备可移植性,其再接种培养后贴壁和细胞迁出情况与正常DP相类似；微组织内迁出的细胞体积稍小,形态类似于正常的DPC。qRT-PCR、免疫荧光染色和免疫印迹检测结果表明：高传代(P8) DPC在二维培养条件下基本丧失包括ALP、α-SMA和NCAM在内的细胞标记物的基因及蛋白表达；而高传代(P8) DPC经三维悬滴培养构建出微组织(3D-P8)后则能恢复和维持上述细胞标记物的表达；成纤维细胞(3D-DF)经三维悬滴培养亦能形成微组织,但其并不表达上述DPC的细胞标记物。3.高传代人毛乳头细胞三维微组织移植后的体内毛囊重建将表皮细胞与高传代(P8) DPC微组织联合移植可重建出完整的毛囊结构,而将表皮细胞与二维培养的高传代(P8) DPC联合移植或仅单纯表皮细胞移植后,均未能诱导重建出毛囊结构；DPC活体荧光示踪标记证实了重建出的毛囊来源于移植的人源性DPC微组织。结论1.通过酶消化结合显微解剖法可分离获得人头皮毛乳头,该方法具有高收获率、高分离效率、低劳动强度和高贴壁迁出率的优点；该方法并未明显影响DPC在体外原代培养时的细胞形态、生长方式和细胞相对特异性标记物ALP. α-SMA的表达,后期实验均采用该方法分离获得人毛乳头。2.人DPC在体外培养时,随着传代次数的增加而逐渐丧失聚集性生长的特性,高传代细胞(高于第6代)基本没有聚集性生长现象；与低传代细胞(低于第6代)相比,高传代细胞其细胞增殖能力和速度均明显降低。3.应用三维悬滴培养模型有利于人DPC聚集形成多细胞球状微组织；其最佳接种培养条件为：DPC以0.25×104/40 μl/孔的密度接种于悬滴培养板内,并于37℃含有5% CO2的培养箱中培养7天后,构建出类似于体内正常毛乳头直径范围(150～250μm)内的微组织数量最多,所形成的微组织形态最稳定,而且微组织内的细胞存活情况最佳；后期实验均采用该条件构建高传代人DPC三维悬滴培养模型。4.通过三维悬滴培养模型构建的高传代人DPC微组织,其组织学结构特点与正常DP相似；微组织内的细胞基本处于一种相对低水平增殖和凋亡的稳定状态；微组织具备注射性和可移植性,再次接种后其仍具备自然贴壁及细胞迁出的能力,具有与体内正常毛乳头相似的生物学特性。5. qRT-PCR、细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹实验结果均证实：通过三维悬滴培养模型构建的高传代DPC微组织,可以恢复和维持细胞内标记物ALP、α-SMA和NCAM的表达,表明微组织可保留DPC自身所特有的生物学特性。6.通过三维悬滴培养模型构建的高传代DPC微组织,在细胞生长方式、微组织直径、细胞生物学特性和细胞特有标记物的表达上均与体内正常的毛乳头相似,因而是一种仿生的微组织。7.通过三维悬滴培养模型构建的高传代人DPC仿生微组织,不仅能恢复和维持高传代细胞的生物学特性和生物学功能,还可用于注射移植进行体内的毛囊重建,具备较大的临床应用前景及价值。