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无尾两栖类是水生到陆生的过渡类群,在其生活史中需经历卵、蝌蚪和蛙三种形态。因其分和范围广,种类和数量较多,易采集等特征,一直是科研和教学的良好材料。掌握无尾两栖类的发育过程,可为细胞生物学和发育生物学的教学和科研打下基础。昭觉林蛙(Rana chaochiaoensis)隶属于脊椎动物门(Chordata)两栖纲(Amphibia)无尾目(Anura Rafinesque)蛙科(Ranidae Gray)蛙属(Rana)。主要分布于云、贵、川三省。云南除滇南和滇西南外均有分布,属我国特有种。分布在昆明地区的昭觉林蛙10月底11月初产卵,蝌蚪期长,至翌年5月才全部变成幼蛙。
目前,关于昭觉林蛙的报道涉及成体外部形态特征、栖息地利用和习性分析,未见发育方面的资料。本项工作从2007年10月12日起至2008年11月22日止,有效工作日230d。采用连续观察法,记录昭觉林蛙胚胎和蝌蚪发育历时。参考前人的研究结果对胚胎和蝌蚪发育进行分期,描绘各发育期的特征,通过测量体重、体积、体长等,得出昭觉林蛙蝌蚪生长发育趋势。另,设置14℃、17℃、20℃、23℃4个恒温组,14→17℃、14→20℃、14→23℃、17→20℃、17→23℃、20→23℃6个变温组,比较在不同温度下,不同时期变温,胚胎完成发育所需时间和生长状况。较系统地研究了昭觉林蛙胚胎及蝌蚪发育,初步探讨了环境因子-温度对胚胎发育的影响。旨在通过研究,明确昭觉林蛙变态前的发育过程,为研究两栖类的起源、地理分布和系统分化提供重要证据;同时也为无尾两栖类的发育、野外种群恢复与人工养殖提供基础资料和参考数据。
数据整理均采用Excel;采用SPSS13.0软件包中单因素方差分析,对各期性状的差异,恒温下和变温下胚胎发育时长的差异、胚胎体尺变化的差异进行分析;曲线回归分析蝌蚪后肢长与时间的关系,体重与体积的关系,发育时长、出膜时间与温度的关系,结果表明:
(1)在16.89±2.47℃的水温条件下,昭觉林蛙胚胎发育从受精卵期到鳃盖闭合期共分为23期,历时299.39h,与沼水蛙、棘胸蛙等蛙科种类相比,其胚胎发育历时最长。胚胎发育特点有,第三次卵裂为纬裂,第四次卵裂(16细胞期)不规则不同步;胚胎多在肌肉效应期出膜,属于孵化比较早的;鳃血循环前无法辨别心跳,且鳃血循环与尾血循环几乎同时开始。各期之间外膜直径、内膜直径差异极显著,胚长、尾长差异极显著。昭觉林蛙受精卵及胍胎早期,受精膜及周围的胶膜弹性较好,不易被破坏,能对受精卵起到很好的保护作用。神经管期,卵膜变薄而松散,利于胚胎出膜,分解前达到最大直径,此时胚胎较脆弱,受外界损伤的几率增加。
(2)在平均水温为18.9±3.2℃的条件下,昭觉林蛙蝌蚪发育从半圆形肢芽到变态完成期共分为16期,历时71.69d。观察中未见圆盾形肢芽期;第1、2趾出现时第三趾同时分离,不将第三趾分离单列为一期;内踱突出现后可观察到各趾关节处透明的瘤状突起,将关节下瘤作为一期;前肢伸出时肩关节即可见,故将前肢伸出期与肩关节露出期合并成为肩部愈合期。四肢出现期,体长达到最大值,是蝌蚪发育的顶峰。此后,肩部愈合期蝌蚪体长、尾长、体宽均明显减小,蝌蚪外部形态发生巨大变化,可视为变态的开始。曲线估计得出昭觉林蛙蝌蚪后肢长与发育时间呈二次曲线关系、体重与体积均呈直线关系。除肩部愈合期外,尾长与头长之比变化不大,可作为昭觉林蛙蝌蚪鉴定的一个参考指标;而常被用作蝌蚪分类指标的齿式,在26-30期时稳定,为Ⅰ:2+2/1+1:Ⅲ。从31期后齿式变得不稳定,有Ⅰ:2+2/1+1:Ⅲ、Ⅰ:2+2/2+2:Ⅱ、Ⅰ:2+2/1+1+1:1+1:Ⅱ、Ⅰ:2+2/1+1+1:Ⅲ、Ⅰ:2+2/1+1+1:1+1+1:Ⅱ等五种齿式出现,作为种类鉴别特征仅在一定的发育阶段有效。
(3)昭觉林蛙胚胎在14-23℃温度范围内出膜率不低于90%,死亡率、畸形率不超过20%,大多能完成正常发育,恒温下,20℃温度条件下胚胎无死亡和畸形,发育时长147.63h,仅稍长于发育历时最短的温度条件(23℃),试验结束后胚胎生长最快,最适合昭觉林蛙胚胎生长。适当高温能加速昭觉林蛙胚胎发育,但高温导致胚胎畸形,并不利于胚胎生长。原肠胚期升温比心跳、鳃血循环期升温更利于昭觉林蛙胚胎发育,可能与外膜的保护作用有关,故胚胎出膜后不益做升温处理。在一定温度范围内,升温起点温度越高,胚胎完成发育时间越短;同一起点温度升温梯度越大,胚胎发育时间越短,且升温起点比温差大小对胚胎发育时长的影响更明显。比较恒温下、原肠胚期升温和心跳、鳃血循环期升温,胚胎发育时长、出膜率、死亡率、畸形率、胚胎性状变化等因素,得出,变温模式下,原肠胚期从17℃升到23℃最利于胚胎生长。