研究背景糖尿病是指血液中胰岛素绝对或相对不足,导致血糖过高,进而引起脂肪和蛋白质等代谢紊乱的一类疾病,临床上可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现。根据国际糖尿病联盟(IDF)公布的第六版“IDF糖尿病地图”显示,2013年我国糖尿病的患病人数为9840万,居世界首位,且95%以上的属于2型糖尿病。控制不当的糖尿病会伴发各种严重的并发症,例如心血管疾病、足部坏疽、肾功能衰竭、失明等,其中心血管疾病特别是糖尿病性心肌病是2型糖尿病的主要并发症和死亡原因之一。糖尿病性心肌病是以慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure, CHF)为表现,且与冠心病、瓣膜疾病无关的特异性糖尿病相关性心脏疾病。患者初期出现亚临床的心功能异常,若不能及时有效的干预治疗,最终进展为心力衰竭、心律失常及心源性休克,重症者甚至猝死。目前,糖尿病性心肌病的防治主要通过包括控制血糖、改变生活方式、降血脂、降血压、抗氧化应激、控制血小板聚集和对症治疗等手段防止疾病的进一步恶化。但由于目前的降糖药物并不能阻止心肌细胞的病理性改变,从心肌组织发生病理性改变到患者有明显的临床表征期间,若没有有效的防治措施,心肌组织的病变将进一步发展为心室收缩功能障碍,从而导致糖尿病性心肌病的防治效果不佳。可见,研发出能同时控制血糖和阻止心肌组织病变的药物对于糖尿病性心肌病的防治具有重大的意义。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种由肠道L细胞分泌的肠激素,可抑制胰高血糖素分泌、促进胰岛β细胞增殖和抑制胰岛β细胞凋亡等,综合降糖作用显著,并且不会引起低血糖,其几种类似物和受体激动剂现已用于糖尿病临床治疗。研究表明GLP-1的受体广泛分布于胰岛、脑、心、肺、肾和胃肠道等多个器官。除了对胰岛细胞具有作用外,GLP-1对机体的多种组织器官都具有一定的作用,如GLP-1通过作用于下丘脑增加饱腹感、延缓胃排空从而减少食物的摄入量；GLP-1可以使黑质纹状体中的多巴胺神经元增加从而增强学习记忆力；GLP-1的类似物利拉鲁肽具有抗炎和抗氧化应激的作用,可以通过抑制内皮细胞中PKC-α和NF-κB信号通路,以及降低NADPH氧化酶的活性来减少炎症因子对内皮细胞的损伤；此外,GLP-1可以抑制慢性心衰大鼠的心肌重构,提高左心室射血分数和舒张期末压,降低心肌梗死后的大鼠死亡率。然而,目前关于GLP-1对糖尿病性心肌病的研究还比较零散,大部分研究集中在GLP-1对慢性心衰和心肌缺血坏死的作用上,没有直接证据表明GLP-1可以修复2型糖尿病导致的心肌损伤和功能障碍。可见研究开发预防和治疗糖尿病心血管并发症的GLP-1新药具有重要的意义。为了研究GLP-1对糖尿病大鼠心功能指标的影响,我们选用Langendorff离体心脏灌流系统来检测糖尿病大鼠的心脏功能指标。离体心脏系统检测是由Oscar Langendorff提出并被广泛应用到生理学和药理学中的研究技术。Langendorff标本通过心脏主动脉插管逆向灌注灌流液,在灌流液压的作用下,动脉瓣关闭,灌流液顺势流入冠状动脉,从而使心脏在离体状态下维持跳动数小时。该方法步骤简洁,实验重复性良好,且可实现在排除神经体液调节的状态下,研究药物对心脏的收缩功能、心率以及冠状动脉特性的影响。由MedLab软件采集到的心功能指标有心率、左心室发展压(LVDP)、左心室收缩压每分上升最大速度(dP/dt max)、左心室舒张压每分下降最大速度(m-dP/dt max)。并将心率与左心室发展压的数值相乘算出心率血压乘积(Heart Rate-Blood Pressure Product,RPP)。RPP是反映左心室做功和心肌氧耗量的一个相关性良好的指标,LVDP和RPP的数值低于正常值说明有左心室功能障碍或者心肌供血不足。dP/dt max和m-dP/dt max是重要的等容收缩相指标,能正确反映心肌收缩性能,相关性优于射血相指标。本课题以GLP-1为主要研究对象,通过建立2型糖尿病大鼠模型,从以下4个方面研究GLP-1对糖尿病造成的心脏组织损伤和功能障碍的保护作用：1.建立糖尿病性心肌病大鼠模型：采用高糖脂肪饮食和合并腹腔注射链脲佐菌素方法建模,观察糖尿病对大鼠心肌组织的损伤和心功能障碍；2.在体GLP-1灌注实验：在大鼠皮下植入渗透压缓释泵持续灌注GLP-1,观察GLP-1对心脏功能和形态学的影响,研究GLP-1对糖尿病性心肌病的预防和治疗作用及其机理；3.离体GLP-1灌注心脏实验：采用Langendorff离体心脏灌流系统,给糖尿病性心脏病大鼠的心脏离体灌注GLP-1,监测GLP-1对心脏功能的影响,研究GLP-1对心肌细胞的直接作用；4.GLP-1保护高糖诱导损伤心肌细胞的机理：体外分离与培养成年大鼠心肌细胞,建立高糖诱导心肌细胞损伤模型,明确GLP-1调控高糖诱导的心肌细胞凋亡相关信号分子的途径,揭示GLP-1的保护机制。目的明确2型糖尿病大鼠心脏功能受损指标和病理基础,观察GLP-1对2型糖尿病大鼠心脏功能的改善和保护作用,研究其可能的作用机制。方法选取SD大鼠80只,随机分为2组：20只正常组和60只模型组。正常组用普通饲料喂养,不做其他任何处理；糖尿病组采用高脂高糖膳食饲养1个月,合并腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导2型糖尿病大鼠模型,注射STZ后第3天检测血糖,血糖值连续2天大于16.7mmol/L视为造模成功。将模型组大鼠按照患病时间的长短依次分为5d组、10d组、15d组和23d组,采用langendorff离体心脏灌流系统检测糖尿病对大鼠心脏功能的影响；苏木素-伊红染色(HE染色)、Masson’s trichrome染色、TUNEL染色观察心肌组织形态学改变。在体实验将糖尿病大鼠分为4组：治疗对照组、GLP-1治疗组、预防对照组、GLP-1预防组。GLP-1治疗组是在患病的第2天给大鼠皮下植入装有GLP-1的胶囊缓释泵,以30mg/kg/min的剂量连续灌注7天,GLP-1预防组是在大鼠注射STZ的前2天皮下植入装有GLP-1的胶囊缓释泵,同样以30mg/kg/min的剂量连续灌注7天,2个对照组均在同期给予等体积的含1%BSA的生理盐水；4组均在大鼠患病第10天用10%水合氯醛麻醉,打开胸腔取心脏。使用langendorff离体心脏灌流系统检测GLP-1对心脏功能指标：心率、LVDP、RPP、dp/dt max、 m-dp/dt max的影响；HE染色观察GLP-1对心肌细胞炎性细胞浸润的影响；TUNEL染色和caspase-3活性分析检测GLP-1对心肌细胞凋亡的影响；Masson’s trichrome染色观察GLP-1对心肌组织中胶原纤维的分布的影响；Western Blot检测GLP-1对心肌细胞BCL-2、JNK、P-JNK表达的影响。离体实验采用langendorff系统,观察GLP-1体外直接灌注心脏对心功能的影响,探究GLP-1对心肌细胞的直接作用。原代分离与培养成年大鼠心肌细胞,分别用高糖、高糖和GLP-1刺激细胞36小时后,观察细胞活力,检测JNK和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果糖尿病组在发病前5天心脏功能出现代偿性增高,与正常组相比,LVDP、 RPP、m-dP/dt max分别增加了5.4%,7.83%和26.44%,(P<0.05)。第10天出现左心室功能异常,心率、LVDP、RPP、dp/dtmax、m-dp/dtmax分别降低了14.67%、19.15%、31.01%、48.61%、20.61%,差异具有统计学意义(P<0.05)。3周后,与正常组相比,LVDP、RPP、dP/dt max、m-dP/dt max分别降低了40.80%,51.50%,50.87%和52.81%,(P<0.05)。形态学观察显示,模型组的心肌细胞空泡变性,心肌纤维局灶性溶解,细胞连续但排列紊乱,横纹不清晰,有明显的中性粒细胞、白细胞浸润。Masson’s trichrome染色显示模型组的心肌纤维之间、血管周围胶原增多,纤维细胞增生,环绕并分隔相邻的心肌细胞。TUNEL显示模型组可见较多绿色荧光核染,凋亡细胞数目增多。体内GLP-1给药实验结果显示GLP-1对正常组的各心功能指标没有显著性影响。与对照组相比,预防组LVDP、RPP、dP/dt max、m-dP/dt max分别增加20.79%,24.04%,37.72%和34.02%,(P<0.05)。治疗组LVDP、RPP、dP/dt max、m-dP/dt max分别增加25.36%,10.90%,22.62%和30.07%,差异具有统计学意义(P<0.05)。形态学观察显示心肌细胞炎症、凋亡减少,心肌组织间及血管周围纤维化降低。Caspase-3酶活性检测结果显示模型组caspase-3酶活性是正常组的1.67倍,GLP-1预防组与对照组相比降低了36.9%。Western Blot结果显示,模型组与正常组相比,Bcl-2的表达量下降26.4%, p-JNK/JNK的表达量是正常组的1.8倍；GLP-1治疗组与对照组相比,Bcl-2的表达量增加了1.31倍,p-JNK/JNK的表达量降低了32.1%；GLP-1预防组与对照组相比,Bcl-2的表达量增加了1.36倍,p-JNK/JNK的表达量降低了34.6%。离体GLP-1灌注心脏实验结果显示,与KH灌流液相比GLP-1可快速提高模型大鼠的各项心功能指标,LVDP、P/dt max、m-dP/dt max分别增高了54.27%、58.37%和33.31%,(P<0.01)。而对心率影响没有显著性意义。细胞实验结果显示：GLP-1可以抑制高糖引起的心肌细胞凋亡。高糖组的p-JNK/JNK比例是正常组的1.8倍,而高糖+GLP-1组的p-JNK/JNK比例是高糖组的0.72倍。高糖组OPN的表达水平是低糖组的2.31倍,而高糖+GLP-1组OPN的表达水平是高糖组的0.77倍,降低了23.4%。结论2型糖尿病大鼠的心功能表现为左心室功能障碍和心肌收缩能力降低,心肌组织出现以间质性纤维化、代偿性纤维化、炎症细胞浸润和凋亡细胞增多为特点的组织损伤。GLP-1对心脏的保护具有治疗和预防双重效应,不仅能通过降低血糖来保护心脏免受高糖氧化应激对心肌的损伤,还可以直接作用于心肌细胞,实现增强心肌收缩能力和改善左心室功能障碍的作用。潜在的作用机制可能与GLP-1增强抗凋亡蛋白Bc1-2的表达、降低caspase-3酶活性、抑制JNK信号分子通路活化、与GLP-1受体结合活化PKA途径有关。本课题研究为将GLP-1用于糖尿病心肌病治疗提供了直接的实验依据和基础。