鹅源星状病毒的分离鉴定及相关生物学特性的研究

来源 :黑龙江八一农垦大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:zgkjzh1
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星状病毒(Astrovirus,AstV)是一种没有囊膜且单股正链的RNA病毒,属于星状病毒科。该病毒目前已从多种哺乳动物以及鸡、火鸡、鸭、鹅和鸽子等禽类中检测出来,与多种动物的腹泻疾病有关。自2017年,在我国山东、安徽、广东、湖南和江苏等地陆续出现雏鹅内脏型痛风病的报道,鹅源星状病毒是引起该病的病原,其致死率可达30%以上,导致养鹅产业严重的经济损失。本研究利用RT-PCR检测鹅源星状病毒阳性;收集结果为阳性的死亡鹅病料的内脏研磨上清进行病毒分离;分离获得两株稳定繁殖的星状病毒毒株:GAstV/Goose/2019/HLJPF和GAstV/Goose/2018/HLJ01;其中GAstV/Goose/2019/HLJPF的ELD50为10-2.6/0.2mL。鹅胚分离传代结果表明病毒接种鹅胚可使胚体全身出血、体生长发育受到抑制或死亡等病变。分析NCBI上公布的GAstV序列,设计合成了一组引物,采取了RT-PCR技术来扩增GAstV的基因组片段,获取GAstV的核酸序列进而拼接GAstV的全基因组,并分析了GAstV的结构组成、抗原表位、系统发育与重组以及氨基酸的突变。测序与分析的结果显示GAstV/Goose/2019/HLJPF与GAstV/Goose/2018/HLJ01的病毒基因组全长分别为7 233bp和7 166 bp,编码3个开放阅读框(ORFs),即ORF1a、ORF1b和ORF2。对2株GAstV病毒的序列进行系统发育分析显示它们属于Avastrovirus,并与Avastrovirus 3和TURKEY Astrovirus有密切关系。此外,ORF1a和ORF2的突变率较高。突变的ORF2蛋白三级结构光滑,其抗原表位高度突变,这可能与病毒的致病性有关,是由宿主的抗体压力引起的。基于鹅源星状病毒的遗传学以及生物特性,本研究采取了原核蛋白表达系统对HLJ01株ORF2衣壳蛋白进行了原核表达,利用纯化后获得的重组ORF2蛋白免疫小鼠制备了针对GAstV ORF2衣壳蛋白的多克隆抗体。同时针对保守区域设计了一对特异性引物,建立了用于检测鹅源星状病毒的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。综上所述,本研究对鹅源星状病毒进行了分离鉴定,同时开展了鹅源星状病毒的生物学特性的研究,并对其基因组序列进行了系统发育分析,预测其蛋白结构功能,建立了用于检测鹅源星状病毒的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,制备了针对其衣壳蛋白的特异性多克隆抗体。为进一步掌握GAstV的发生发展而提供了部分的实践基础和理论支持。
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