研究背景和目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一,也是终末期肾脏病(end stage renal disease, ESRD)患者死亡的主要原因。目前糖尿病肾病的治疗原则主要是控制血糖、血压,控制饮食和改善肾功能,但临床上糖尿病肾病患者一旦进入临床蛋白尿期,尽管基于各种手段,DN患者的肾功能还是会逐渐减退,逐渐发展至ESRD,由此带来的透析、肾移植等治疗费用在整个医疗支出中所占比例正逐年增长,给病人和社会造成极大的经济负担。目前关于DN发病机制的研究既往多集中在血糖、血脂代谢紊乱与血流动力学异常等方面。近年研究发现炎症反应参与DN的发生和发展。肾小球系膜细胞(MCs)和系膜基质增多是糖尿病肾小球硬化的主要病变,MCs分泌细胞因子和细胞外基质,参与肾小球炎症反应过程,促进肾小球硬化,因此研究药物对炎症状态下肾小球MCs增殖和分泌,在糖尿病肾病的治疗中具有十分重要的意义。促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)主要是由成人肾脏产生的一种糖蛋白激素,能特异性地作用于哺乳动物的红系祖细胞,促进其增殖、分化并抑制其凋亡。自人工合成以来一直用于治疗各种疾病导致的贫血,特别是肾性贫血的治疗。EPO通过与EPO受体(EPOR)结合启动细胞内信号转导通路起作用。近年来,EPO的细胞保护作用和器官保护作用备受关注,EPOR不仅存在于红系生成细胞,还存在于全身各组织器官。重组人红细胞生成素(rHuEPO)被认为是一种全身性的、心管系统和肢体保护性细胞因子。其中rHuEPO对神经系统和心血管系统研究较多,临床上已用于神经系统、心血管系统和肢体缺血性疾病的治疗,在肾脏保护方面,目前对急性肾损伤的保护作用机制研究较为透彻的有抗氧化应激、抗凋亡、抗炎症反应。关于EPO在糖尿病肾病的保护作用,研究较少,最近国内外有文献报道EPO对糖尿病肾病动物模型的保护作用。关于EPO对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞的作用目前未见有报道,肾脏是EPO的主要产生部位,且EPO及受体在肾缺血再灌注损伤及毒性物质损伤时表达上调,文献证实EPO受体存在肾小球系膜细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞,表明EPO具有内源性肾脏保护作用。本实验通过体外系膜细胞培养技术,给予高糖环境下,rHuEPO刺激,用流式细胞技术、实时荧光定量PCR及Western bolt等分子生物学技术,观察系膜细胞的形态、细胞增殖和凋亡,检测细胞凋亡相关基因Bcl-2(B-Cell Lymphoma)、caspase-3蛋白的表达,探讨rHuEPO对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖及凋亡的影响并分析可能的机制。材料与方法1、体外培养肾小球系膜细胞,分别培养于正常和高糖葡萄糖浓度环境中,采用CCK-8比色法观察24、48、72小时MCs增殖的情况。选择高糖组浓度为30mmol/L,系膜细胞分组为：空白对照组(NC)、高糖组(HG),高糖和不同浓度的rHuEPO (1、10、50、100、1000IU/ml)干预组,作用24、48、72小时。CCK-8比色法检测细胞增殖能力,观察不同浓度、不同时间rHuEPO对高糖培养的系膜细胞增殖的影响；倒置显微镜动态观察系膜细胞形态和增殖的变化。2、应用ELISA法和实时荧光定量PCR方法检测细胞单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)蛋白和mRNA的表达。3、应用流式细胞仪(FCM)检测rHuEPO对高糖培养的系膜细胞凋亡的影响。4、Western bolt检测caspase-3和Bcl-2蛋白的表达情况。结果1、不同浓度葡萄糖、rHuEPO对系膜细胞增殖的影响在30mmol/L以下时,不同浓度的葡萄糖培养系膜细胞24、48、72小时发现,葡萄糖对系膜细胞的增殖呈浓度和时间依赖性,以30mmol/L培养72小时反应最佳,40mmol/L和50mmol/L的葡萄糖有抑制系膜增殖的效应。选择高糖组葡萄糖浓度为30mmol/L,分别加入不同的rHuEPO浓度,rHuEPO在低于100IU/ml能促进高糖诱导的MCs增生,呈剂量和时间依赖性,rHuEPO在1000IU/ml时,细胞毒性明显,大部分细胞死亡2. ELISA法检测细胞培养上清MCP-1、TGF-β1含量,real time FQ-PCR方法检测细胞MCP-1、TGF-β1mRNA的表达正常培养的系膜细胞MCP-1、TGF-βmRNA有低水平的表达,高糖组刺激24、48、72小时均有高水平的表达,rHuEPO在1、10、50、100IU/ml时,作用于高糖培养的MCs,细胞MCP-1、TGF-β1mRNA的表达均显著降低。3、各组系膜细胞的凋亡情况对照组系膜细胞有一定的凋亡率,高糖组系膜细胞早期凋亡和晚期凋亡明显增加,rHuEPO在1、10、50、100IU/ml时,作用于高糖培养的MCs,可抑制高糖培养系膜细胞的凋亡。4、系膜细胞Bcl-2和Caspase-3的表达情况正常对照组系膜细胞表达高水平的Bcl-2和低水平的Caspase-3,高糖组作用后Bcl-2表达降低,Caspase-3表达升高,较对照组差异有统计学意义,rHuEPO在1、10、50、100IU/ml时,Bcl-2蛋白表达量增加,Caspase-3蛋白表达量降低,与高糖组比较有统计学意义。结论1、高糖在一定浓度和时间内有刺激系膜细胞增殖的效应,大剂量1000IU/ml rHuEPO对高糖培养的系膜细胞有细胞毒性,小剂量(1-100IU/m1)rHuEPO可刺激高糖培养的系膜细胞的增殖,呈浓度和时间依赖性。2、高糖增加系膜细胞MCP-1、TGF-β1蛋白和mRNA的表达,1-100IU/ml rHuEPO能抑制高糖培养的MCs MCP-1、TGF-β1蛋白和mRNA的表达。3、高糖培养的系膜细胞凋亡增加,rHuEPO能抑制高糖培养的MCs的凋亡,可能与凋亡相关的基因Bcl-2表达上调,Caspase-3表达下调有关。研究背景和目的贫血是终末期肾脏病(ESRD)血液透析(HD)患者最常见的并发症,贫血可以引起患者组织氧供减少、左室肥厚(LVH)、充血性心力衰竭(CHF)、肌肉易疲劳、运动耐力和机体免疫力下降等,ESRD HD患者死亡率升高。重组人促红细胞生成素(rHuEPO)在临床的广泛应用大大减少了肾性贫血的发生率,大部分肾性贫血得到了有效的治疗,但rHuEPO的反应性在不同的患者表现不同,大约90-95%的患者对rHuEPO有良好的反应性,血红蛋白水平能维持在11-12g/dl或以上水平,但5-10%的ESRD患者rHuEPO反应性差或无反应,血红蛋白水平不能维持在11-12g/dl或以上水平,存在明显的rHuEPO抵抗。文献报道,许多因素参与rHuEPO抵抗的发生,包括铁缺乏、慢性炎症、急性感染、失血、甲状旁腺功能亢进、VitB12和叶酸缺乏等。其中最常见的一个原因是铁缺乏。其中包括了铁的绝对不足以及功能性铁缺乏。功能性铁缺乏是指体内铁储备充分,而铁不能被充分利用。但一部分患者铁补足后,仍存在rHuEPO抵抗。rHuEPO抵抗的另一个重要原因归因于慢性炎症,但这些因素排除后,仍有一些患者存在rHuEPO抵抗。Hepcidin是一种由肝脏细胞产生的由25个氨基酸组成的具有广谱杀菌抑菌作用的抗菌肽,属于防御性蛋白家族。近年研究发现铁调素(Hepcidin)在维持铁代谢平衡中起着关键性的调控作用,参与多种铁代谢疾病的发病机制。Hepcidin可以在患者尿液中和超滤液中检测到。文献报道体内铁负荷、慢性炎症和IL-6可以使hepcidin水平升高,贫血,缺氧和rHuEPO治疗可以使hepcidin水平下降。Hepcidin与膜铁转运蛋白(FP1)结合发挥作用,后者在十二指肠、肝细胞及巨噬细胞存在高表达,FP1水平降低时,hepcidin可抑制铁的释放,hepcidin在慢性病的贫血中发挥重要作用。近年研究发现细胞因子介导的炎症抑制骨髓红细胞的生成为ESRD患者贫血的一个重要原因,表现为C反应蛋白(CRP)升高,认为慢性炎症可能为rHuEPO抵抗性贫血的一个重要原因。HD透析患者慢性炎症可以调节hepcidin生成,血液透析患者hepcidin水平升高。但是hepcidin在肾性贫血中的发病机制仍不是很清楚。有研究表明ESRD患者hepcidin在体内蓄积,HD患者不同的透析方式可对hepcidin的水平产生影响。目前由于hepcidin分子量小,检测较困难,对设备要求较高,限制了广泛应用,我们通过测定其前体pro-hepcidin水平了解体内hepcidin水平。该课题通过临床观血液透析肾性贫血患者与促红素抵抗患者体内pro-hepcidin的水平、炎症因子(hs-CRP)以及铁代谢状态,研究pro-hepcidin与rHuEPO抵抗肾性贫血、慢性炎症及铁代谢状态的相互关系,观察pro-hepcidin是否参与rHuEPO抵抗肾性贫血的发病,为将来接受EPO治疗患者提供有效的诊断和决策参考。研究目的如下：1、ELISA法测定MHD患者、rHuEPO抵抗性贫血患者及健康对照者血清pro-hepcidin水平。2、分析ESRD MHD患者rHuEPO抵抗与铁代谢、慢性炎症和pro-hepcidin之间的关系。3、ROC曲线预测hepcidin对rHuEPO抵抗的诊断价值。材料与方法1.MHD患者40例入选,其中20例为rHuEPO反应良好组,20例为rHuEPO抵抗组,另选择20例健康体检者作为对照组。2.一般资料采集：血液透析患者均于透析前动静脉瘘处取血，健康对照组于清晨空腹取肘静脉血。分别检测血红细胞计数，血红蛋白浓度，红细胞积压，及肝肾功能等生化指标，pro-hepcidin、hs-CRP、铁代谢指标。3.测定指标：HD患者和健康对照常规检测血液学指标及生化指标,铁代谢指标包括血清铁蛋白、血清铁和总铁结合力(计算转铁蛋白饱和度)、iPTH、叶酸和VitB12, MHD患者测定透析前后血尿素氮和肌酐水平。4.检测方法：(1)血清Pro—hepcidin:ELISA方法(2)血清hs-CRP:透射比浊法测定。(3)血清铁蛋白：微粒子发光法检测。(4)血清铁和总铁结合力：亚嗪比色法测定,计算出转铁蛋白饱和度(TSAT) TSAT=(血清铁/总铁结合力)×100。(5)叶酸和VitB12:微粒子酶联免疫法检测。(6)iPTH：电发光法检测。(7)透析充分性计算：Kt/V=-ln(R-0.008t)+(4-3.5R)UF/W URR=100(1-Ct/Co)(8)常规检测血脂、肾功、肝功等生化指标、血细胞各项参数。5.统计方法：应用SPSS13.0软件包进行统计学处理,符合正态分布或近似正态分布的计量资料以x±s表示,用独立样本t检验分析组间差别,计数资料采用χ2检验,影响EPO反应性的因素采用Spearman等级相关分析,以P<0.05表示差异有统计学意义,多元逐步回归分析影响pro-hepcidin的因素,ROC曲线预测pro-hepcidin对EPO抵抗的诊断价值。结果HD患者血清铁蛋白、血清pro-hepcidn、hs-CRP明显高于正常患者,TF明显低于正常患者,EPO抵抗的患者血清铁蛋白、血清pro-hepcidin、hs-CRP明显高于反应正常的患者。血清pro-hepcidin水平与血清铁蛋白和hs-CRP密切相关,多元逐步回归分析显示影响血清pro-hepcidin的因素有SF、SI和hs-CRP,预测EPO抵抗诊断价值的ROC曲线示pro-hepcidin、SF和hs-CRP的曲线下面积分别为0.713、0.769、0.958,其中hs-CRP预测价值最大。结论HD患者pro-hepcidin水平明显升高,rHuEPO抵抗与慢性炎症、铁代谢水平密切相关,血清pro-hepcidin、SF、hs-CRP是rHuEPO抵抗的标志。