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研究目的酒精是一种重要的肝脏毒物,过度饮酒会导致酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver,AFL)、酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化等一系列逐渐进展的肝脏疾病,即酒精性肝病(alcoholic liver diseases,ALD)。目前,ALD尤其是重度阶段的ALD缺乏有效的治疗方法。AFL因具有可逆性,故其是对ALD进行有效干预的最佳阶段。探究AFL发病的分子机制可筛选出能有效防治ALD的潜在分子靶点。Kupffer细胞(Kupffercells,KCs)是肝脏内的常驻巨噬细胞,在多种肝脏疾病的发生和发展过程中起着重要作用。KCs被激活后,可释放活性氧(reactive species oxygen,ROS)和炎症介质如 TNF-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等。研究证明,KCs 在慢性ALD的发病中扮演着重要的角色,但关于 KCs在急性AFL发病中的作用仍待阐明。本研究通过Binge Drinking诱导的急性AFL小鼠模型和离体培养脂肪组织实验,研究KCs特异性抑制剂三氯化钆(GdCl3)和TNF-α受体融合蛋白(益赛普)对急性AFL的拮抗作用,并从肝细胞内氧化应激、肝脏脂肪分解和合成代谢以及外周脂肪动员等方面进行分子机制探讨。研究方法1.动物实验SPF级雄性C57BL/6小鼠(18-22 g)50只,适应性饲养一周后,随机分为对照组(Control),模型组(Ethanol)和三氯化钆+乙醇组(GdCl3/Ethanol),益赛普+乙醇组(Etanercept/Ethanol)和 N-乙酰基半胱氨酸 + 乙醇组(NAC/Ethanol)组(n= 10)。采用灌胃给予6 g/kg b.w.乙醇(连续给予3次,两次间隔12 h)来诱导急性AFL。GdCl3、益赛普和 NAC 的剂量分别为 10 mg/kg b.w.、1 mg/kg b.w.和 100 mg/kg b.w.(i.p.)。在第一次乙醇暴露前24h,GdCl3和NAC干预组小鼠分别给予GdCl3和NAC;随后在每次乙醇暴露前1 h分别给予相应的药物;对照组小鼠给予等能量的麦芽糖糊精溶液以及腹腔注射等体积等能量的生理盐水溶液。末次酒精暴露6h后,小鼠摘眼球取血分离血清;随后脱臼处死动物,迅速分离肝脏和附睾脂肪组织,分别用于病理学检测、生化分析、蛋白电泳以及PCR半定量分析。通过H&E染色和油红O染色观察肝脏组织病理学变化。采用试剂盒检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)的活性,以及肝脏中甘油三酯(triglyceride,TG)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量。通过westernblotting和qPCR技术测定PPAR-α(peroxisome proliferator-activated receptor α,PPAR-α)、SREBP-lc(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)、ACOX-1(acyl-CoA oxidase,ACOX)、FAS(fatty acid synthase,FAS)、ACC(acyl-CoA carboxylase,ACC)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase,SCD-1)等调控脂肪代谢的分子蛋白和mRNA水平。2.体外实验SPF级雄性昆明小鼠(25-30 g),断头处死,无菌条件下取出两侧附睾脂肪,用眼科剪剪成0.5-1 mm3大小的均匀颗粒,在细胞培养箱中培养1.5 h后,加入不同浓度的TNF-α作用0.5-8 h,收集细胞检测离体脂肪组织中激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase,HSL)及其磷酸化水平,并检测细胞培养液中游离脂肪酸(free fatty acid.FFA)的水平。研究结果1.GdCl3和益赛普对急性乙醇暴露导致的小鼠肝脏脂肪蓄积的影响:与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝脏TG含量显著增加(P<0.05);与模型组小鼠相比,三种药物干预组小鼠肝脏中TG含量分别减少了 21.69%、20.88%和35.57%(P<0.05)。病理学检查可见模型组小鼠肝细胞中有大量大小不等的脂肪滴,而三种药物干预组小鼠脂肪滴数量明显减少。2.GdCl3和益赛普干预对急性乙醇暴露引起的KCs激活的作用:与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝脏内F4/80蛋白和mRNA含量分别升高了 309.0%和62.32%(P<0.05)。与模型组小鼠相比,GdCl3+乙醇组小鼠肝脏内F4/80蛋白和mRNA含量分别降低了 64.62%和52.40%(P<0.05);而益赛普和NAC干预组小鼠肝脏内该蛋白及mRNA水平未见显著改变。3.GdCl3和益赛普对急性乙醇暴露引起的的小鼠肝脏氧化应激的影响:与对照组小鼠比较,模型组小鼠的NO和MDA含量分别升高了45.35%和217.57%(P<0.05)。与模型组小鼠相比,GdCl3+乙醇组、益赛普+乙醇组和NAC+乙醇组小鼠肝脏内NO和MDA水平分别降低了 22.77%、28.86%和 27.09%(P<0.05)。4.GdCl3和益赛普对急性乙醇暴露对小鼠肝脏中SREBP-1c调控的脂肪合成通路的影响:成熟形式的SREBP-1c(mSREBP-1c,68 kD)的蛋白含量在各组小鼠之间未见明显变化。与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝脏内的ACC、FAS和SCD-1三者的蛋白含量显著降低(P<0.05)。与模型组小鼠相比,GdCl3+乙醇组小鼠肝脏ACC和FAS的蛋白含量进一步降低,益赛普+乙醇组小鼠肝脏ACC和FAS的蛋白含量有不同程度的增加,而NAC+乙醇组小鼠肝脏上述2个分子的蛋白含量无明显改变。5.GdCl3和益赛普对急性乙醇暴露对小鼠肝脏中PPAR-α调控的脂肪酸氧化分解代谢通路的影响:与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝肝脏内的PPAR-α和ACOX的蛋白和mRNA水平均显著降低(P<0.05)。与模型组小鼠相比,GdCl3和NAC干预组小鼠肝脏内PPAR-α和ACOX的蛋白和mRNA水、平无明显变化,而益赛普组小鼠肝脏内ACOX的蛋白含量显著增加(P<0.05)6.GdCl3和益赛普对急性乙醇暴露对小鼠附睾脂肪组织脂肪动员的影响:与对照组小鼠相比,模型组小鼠脂肪HSL和p-HSL(p563、p565、p660)的蛋白含量均显著增加(P<0.05)。与模型组小鼠相比,GdCl3和NAC十预组小鼠附睾脂肪HSL蛋白含量显著降低(P<0.05);三种药物干预组小鼠肝脏p-HSL563、p-HSL565和p-HSL660的蛋白含量有不同程度的降低。7.TNF-α对体外培养的附睾脂肪动员的影响:TNF-α(10ng/ml、作用时间1h)可导致附睾脂肪组织中HSL及其磷酸化形式蛋白表达量明显升高;随着TNF-α作用时间的延长,该蛋白的表达量逐渐降低。在TNF-α暴露1 h时间点,不同浓度TNF-α干预的脂肪组织上清液中FFA含量显著增加;在浓度为0.1ng/ml～5ng/ml范围内,上清液中FFA含量随着浓度增加而增加;在浓度为10ng/ml～20ng/ml,FFA浓度达到平台期。结论1.GdCl3和益赛普均能减轻急性酒精暴露导致的脂肪肝。2.KCs在急性酒精性脂肪肝发病中的作用可能与其释放的TNF-α介导的外周脂肪动员有关。