维生素A修饰的纳米载体靶向肝星状细胞沉默TLR4基因并抑制肝纤维化的实验研究

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研究背景与目的:肝纤维化是以细胞外基质(ECM)蛋白过度积聚为特征,发生在大多数类型的慢性肝病中,后期常伴有门脉高压、肝功能衰竭、易受感染或发生肝细胞癌(HCC)。静止肝星状细胞(HSCs)位于Disse空间,储存大量的维生素A(VA)。活化的HSCs是参与肝纤维化的主要细胞,生成大量的ECM被认为是肝纤维化的始动环节。因此,抑制HSCs的活化和增殖可能是一种有效的抗纤维化治疗方法。制备由维生素A(Vitamin A,VA)修饰的纳米载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺(PEG-PEI),用于靶向肝星状细胞(LX-2细胞株)输送TLR4 si RNA。观察及评估VA-PEG-PEI对LX-2细胞的转染效率、TLR4/NF-κB信号通路及α-SMA表达的影响。在体外细胞水平,实现对HSCs的TLR4/NF-κB信号通路的靶向调控,从而探讨一种治疗肝纤维化新策略的可能性。方法:1.维生素A-聚乙二醇--聚乙烯亚胺纳米载体的合成。2.纳米复合物的水合粒径和zeta电位的检测。3.琼脂糖凝胶阻滞电泳试验用于评估纳米载体负载si RNA的能力。4.用CCK8法检测纳米基因药物的细胞毒性。5.通过流式细胞术及荧光显微镜观察纳米材料的转染效率。6.用脂多糖(LPS)刺激LX-2细胞,并用不同的多聚体(VA-PEG-PEI/si TLR4或PEG-PEI/si TLR4)进行转染。7.用实时荧光定量聚合酶链式反应、蛋白质免疫印迹法和免疫荧光法分别测定LX-2细胞TLR4/NF-κB信号通路信使RNA水平、蛋白水平和α-SMA的表达。结果:高浓度(40ug/m L)的VA-PEG-PEI/si TLR4孵育的LX-2细胞仍然具有80%以上的存活率,表明纳米药物的细胞毒性较低。琼脂糖凝胶阻滞电泳试验提示纳米载体VA-PEG-PEI具有良好的si RNA负载能力。LPS刺激的LX-2细胞TLR4/NF-κB信号通路水平升高,经VA-PEG-PEI/si TLR4处理后,这种作用明显减弱。同时,VA-PEG-PEI/si TLR4能够有效地使LX-2细胞失活,这点可通过降低纤维化标志物α-SMA的表达来证明。结论:VA-PEG-PEI/si TLR4能够高效地转染si RNA,并有效下调了LX-2细胞中TLR4/NF-κB信号通路和α-SMA的表达。我们的体外实验研究表明,VA-PEG-PEI/si TLR4具有治疗肝纤维化的巨大潜力。
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