背景类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是累及关节的慢性自身免疫性疾病,其病理特征主要是炎症细胞浸润与滑膜细胞增生,严重影响人们的健康状态和生活质量。迄今为止,RA的病因及发病机制仍不十分清楚,多数学者认为与感染和细胞免疫状态相关。HMGB1是高迁移率族蛋白超家族的成员之一,是一种富含非组蛋白的核蛋白。分泌到细胞外的HMGB1被认为是一种重要的炎症细胞因子。近年的研究表明,HMGB1也参与自身免疫性疾病,如RA、SLE等。Th17作为新发现的炎症性细胞,主要参与炎症和自身免疫性疾病。我们前期的研究表明,在类风湿性关节炎患者,存在着Th17细胞上调和HMGB1优势表达的微环境状态,且表明其与类风湿性关节炎的发生发展有着密切的关系。本研究旨在进一步探讨HMGB1对Th17等免疫细胞的调节路径和相关信号传导途径,研究他们之间的相互关系及其在类风湿性关节炎中的作用机制,为寻找类风湿性关节炎治疗的新途径奠定基础。目的建立自制鸡Ⅱ型胶原诱导的关节炎小鼠模型,分析TLR在关节炎小鼠PBMC和RAW264.7细胞系的分布及其血清相关细胞因子表达水平的变化；进一步在检测临床类风湿性关节炎患者外周血相关细胞因子的变化和单核细胞TLR2、IL-17表达水平的基础上,探讨TLR2在类风湿性关节炎患者单核细胞表达与Th细胞水平变化的关系及其参类风湿性关节炎发生的免疫机制。方法1.小鼠Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型的建立：将CFA与CⅡ溶液1：1混合于研钵中,CⅡ终浓度为1mg/mL,置于冰盒上继续研磨到油包水状态。然后吸入一次性注射器中,固定好DBA/1小鼠,于尾根部1cm处皮下注射,每只为100μL。于第21天进行再次免疫,将IFA与CIⅡ溶液1：1混合于研钵中,同样于尾根部约1cm处皮下注射,每只约100μL,尽量避免与初次注射相同位置。于第二次免疫后每天观察小鼠的发病情况,进行实时记录小鼠发病时间,并测量小鼠发病时脚趾的厚度,观察炎症情况评价炎症得分等。炎症评分标准：根据小鼠踝关节、跖趾关节、趾关节红肿程度和受影响关节数进行评分。0分：正常；1分：1个关节的红肿；2分：2个及2个以上关节的红肿；3分：波及全足的严重红肿；4分：严重红肿且不能负重。四肢分别进行评分,累计总和为炎症得分。2.荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测外周血单个核细胞或单核细胞IL-17、IL-6、IL-23、TGF-β以及TLR2等mRNA表达水平：应用TRIzol分离细胞总RNA、无RNA酶双蒸水洗脱,进行逆转录PCR。荧光定量PCR扩增并分析相关细胞因子和TLR2等mRNA的表达水平,简言之,应用7500快速Real-Time PCR扩增仪,于总反应体积20μl(5μlSYBR Green1,0.4μl引物,0.06μlTagDNA多聚酶,2.5μlddH2O和2μlcDNA)中进行PCR扩增试验。通过Tm值分析扩增产物的特异性,样本中目的基因的拷贝数应用Biosystem软件根据标准曲线计算。3.免疫组化染色分析IL-17分泌细胞：应用免疫组化染色的方法检测浸入CIA小鼠模型病变局部的IL-17分泌细胞(Th17细胞)和类风湿性关节炎(RA)患者外周血单个核细胞中Th17细胞的比例,以及体外HMGB1刺激后Th17细胞的变化,探讨此类细胞在CIA和RA发生发展过程中的变化和HMGB1在其中发挥的作用。4.流式细胞仪分析TLR2的表达和分选CD14阳性单核细胞：检测细胞表面膜分子,以确定外周血单核细胞及其TLR2表达水平。外周血单个核细胞悬液与TLR2单克隆抗体共育,细胞洗后在与FITC标记的抗CD14单克隆抗体共育,洗涤后重新悬浮于含1%FCS/PBS溶液,流式细胞仪上样分析和分选。5.酶联免疫吸附试验分析细胞因子浓度：类风湿性关节炎患者血浆中IL-6、IL-23、IL-17等细胞因子浓度和体外培养的单核细胞的细胞因子分泌水平,应用ELISA间接法进行检测。6. Westernblot分析单核细胞NF-KB的表达水平：单核细胞溶解后于12%SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜上。将膜置于5%去脂奶Tween20磷酸缓冲盐水中,室温放置1小时,酶标记的抗NF-kB抗体4。℃反应过夜,发光仪检测并作图像分析。结果1.应用自制的鸡Ⅱ型胶原诱导Balb/c小鼠,成功建立了鸡Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎模型,小鼠关节炎的发病率为100%,平均发病时间为35±5天,关节炎症得分为10±2分。2.体外试验表明,巨噬细胞系(RAW)表面可表达TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9等。在CIA造模成功的基础上,研究发现模型鼠Th17细胞的浸润可见于CⅡ免疫接种45天后。CⅡ刺激的腹腔巨噬细胞TLR2的表达量增加。此外,腹腔巨噬细胞TLR2、TLR4、TLR8、TLR9等mRNA表达水平在模型鼠呈现明显的增加,且血清IL-6、IL-17、TGF-β、IL-1β含量也明显升高。经抗TLR2抗体封蔽后,上述TLR的表达和细胞因子的表达量则明显降低。3.流式细胞仪分析表明,在RA患者,其外周血中CD14+单核细胞比例明显增加,且单核细胞表面的TLR2表达也增加,与健康对照组相比有显著差异(P<0.001)。此外,RA患者血清IL-17、IL-23、HMGB1等细胞因子水平和单个核细胞培养上清的IL-6、IL-23和TGF-β蛋白含量均有明显增加。4.体外HMGB1刺激可增强单核细胞TLR2的表达水平和IL-23、IL-17、IL-6等细胞因子的分泌水平,与无HMGB1体外刺激的单核细胞相比有显著性差异；这种HMGB1刺激TLR2、IL-23、IL-17和IL-6表达上调的效应,在来源于RA外周血的CD14阳性单核细胞则表现得更加明显,与健康对照组来源的单核细胞相比有显著性差异(p<0.001)5.免疫组化分析表明,类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞中分泌IL-17的细胞比例明显增加,尤以HMGB1刺激后为著。6.Western blot分析结果显示,与HMGB1共育的RA患者外周血单核细胞的NF-κB表达明显增加。结论1.CIA小鼠模型和类风湿性关节炎的研究均表明,在疾病发生发展过程中HMGB1、Th17及其相关细胞因子均明显上调,且同时伴有IL-1β、IL-6、IL-17和TGF-β表达的增强,表明HMGB1和Th17细胞均与类风湿性关节炎的发病和病程相关。那么同处于共同微环境的HMGB1和Th17细胞的关系如何?启发了我们进一步深入研究的思路。2.在类风湿性关节炎患者,外周血CD14阳性的单核细胞表面TLR2的表达水平升高。且体外HMGB1可有效刺激单核细胞表面TLR2的表达水平,同时类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞的Th17细胞比例增加。抗TLR2单克隆抗体可阻断HMGB1的这种刺激作用。当抗TLR2抗体应用后,HMGB1刺激上调单核细胞TLR2的表达和分泌IL-1β、IL-6、IL-17的促进作用同样受到抑制。首次表明HMGB1可能是通过TLR2途径促进炎症时Th17细胞的上调。3.HMGB1对类风湿性关节炎患者外周血单核细胞NF-κB的表达增加,可能参与TLR2的信号转导途径。由此推测,在类风湿性关节炎的发生发展过程中,炎症损伤时释放和分泌的HMGB1增加,增加的HMGB1则通过与TLR2的结合进一步刺激巨噬细胞等分泌IL-1β、IL-6、TGF-β等细胞因子并活化NF-κB信号转导途径。