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艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染导致人体免疫机能缺陷而易于发生机会性感染和肿瘤的临床综合征。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)能抑制HIV复制,降低AIDS的发病率和死亡率,但仍存在药物无法彻底清除HIV、难以在HIV病毒贮库中达到有效浓度、长期用药易产生多药耐药等问题。因此,针对HIV贮库开发新的给药系统是当前国际上抗AIDS研究中的一个热点和难点。由于巨噬细胞是HIV病毒贮库中至关重要的一个细胞群,近年来主动靶向巨噬细胞的给药系统研究成为一个新的热点。
在抗HIV药物靶向载体中,脂质体是研究最多、最有临床应用前景的一类载体。脂质体能促进某些抗HIV药物的细胞内传递,增强药物的治疗效果。但未经修饰的脂质体只具有被动靶向性,为了更特异性地靶向HIV感染细胞,本文设计了一种能够与巨噬细胞膜上的半乳糖颗粒受体特异性结合,主动靶向巨噬细胞的新型脂质体:半乳糖酯修饰的齐多夫定硬脂酸酯脂质体,并进行体外主动靶向性的评价研究。预期这种新型脂质体对HIV病毒贮库(巨噬细胞)具有高度选择性,能减少AIDS治疗过程中耐药株出现的机率。其可以作为抗艾滋病药物的理想剂型,也可以作为其他抗病毒药物的靶向给药剂型,具有良好的应用前景。
本文的研究内容主要包括以下方面:
1.自主合成了齐多夫定(AZT)的脂溶性前药齐多夫定硬脂酸酯(AZTS)和具有主动靶向巨噬细胞膜上半乳糖颗粒受体功能的半乳糖酯,即D-半乳糖基-4[(4-{[(胆甾烷-3-氧基)羰基]氨基}丁基)氨基]-4-羰基丁酯(D-galactosyl-4-[(4-{[(cholestan-3-yloxy)carbonyl]amino}butyl)amino]-4-oxobutanoate,缩写为GCOE)。与AZT相比,AZTS的脂溶性明显提高(logPoct=5.22),更适宜脂质体制剂的制备;AZTS脂质体包封率高,且不易泄露。本文中合成GCOE的反应条件温和,用正相硅胶柱即能有效分离纯化,操作简单。
2.建立了AZTS的体外HPLC分析方法和AZTS脂质体包封率的测定方法(微孔滤膜过滤分离-HPLC检测药物含量),采用薄膜分散法或乙醇注入法结合挤出仪整粒技术制备AZTS脂质体。最优处方为磷脂含量为5％(W/V),药脂比为1:20(W/W),总胆固醇与磷脂的质量比为1:4,GCOE与胆固醇的质量比为2:1。制备的脂质体包封率高(85％以上),粒径较小且均一(平均粒径180nm,多分散指数0.371)。
3.对GCOE修饰的脂质体进行了初步的体外靶向性评价。GCOE对小鼠巨噬细胞RAW264.7没有毒性,生物相容性良好。通过与蓖麻凝集素的特异性凝集反应证实了GCOE的亲脂性胆甾烷基插入脂质体的磷脂双分子层,亲水性的半乳糖基暴露于脂质体外面,能与蓖麻凝集素特异性结合。由于AZTS本身不能激发荧光,本实验选择了具有大共轭系统,激发的荧光性质较稳定的阿霉素(DOX)作为荧光探针制备荧光脂质体,对GCOE修饰的荧光脂质体与巨噬细胞的体外亲和力作了定性评价;同时,用MTT法对GCOE修饰的AZTS脂质体、DOX脂质体与巨噬细胞的体外亲和力作了定量评价。结果表明,经GCOE修饰后,脂质体与巨噬细胞的亲和力显著增强,能携载更多的药物进入巨噬细胞内。GCOE能实现主动靶向巨噬细胞的能力,预期经GCOE修饰的脂质体在抗HIV治疗中有良好的应用前景。