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细胞表面展示技术已广泛应用于突变文库的高通量筛选,有力地促进了蛋白质工程的发展。枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)脂肪酶A (LipA)具有独特的结构特点和催化活性,作为一种重要的工业生物催化剂,已广泛应用于制药、高分子材料合成等领域。本文将脂肪酶LipA功能性地展示到大肠杆菌细胞表面,为后续高通量筛选LipA突变基因文库,奠定了坚实的基础。本研究首选从枯草芽胞杆菌中克隆HpA基因,经测序并提交到NCBI核酸数据库(登录号为JX048066)。该基因全长639bp,编码212个氨基酸残基。与其它已得到功能验证或结构解析的枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA具有高度的同源性。序列比对分析结果表明：Ser108、Asp164和His187构成了LipA活性中心的催化三联体,其中Ser108位于保守五肽中。将LpA成熟肽编码基因插入到表达载体pET22b中,获得重组表达质粒pET22b-lipA。以E. coli BL21(DE3)为表达菌株,IPTG为诱导剂诱导lipA基因的表达,制备重组LipA蛋白。用镍柱亲和层析柱对表达的脂肪酶进行了分离纯化。SDS-PAGE电泳检测为单一条带。通过重叠PCR技术,获得脂肪酶lipA与铜绿假单胞菌自转运蛋白EstA羧基端结构域编码区融合的重叠基因,并插入到改造后的pACYC载体中,构建表面展示载体pBCMB-X2。将表达载体pBCMB-X2分别导入到大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600菌株中,以IPTG诱导融合基因的表达。分别用三丁酸甘油酯定性检测和pNPD定量检测诱导表达后的全细胞脂肪酶的水解活性。实验结果表明：LipA在大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600细胞表面均实现功能性展示。在三丁酸甘油酯平板上,菌落周围有明显的水解圈；而pNPD定量测定水解活性分别为2.8±0.1U/OD600和2.6±0.06u/OD600。