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目的：
建立稳定表达HCV C蛋白的CHO细胞模型,为研究HCV C蛋白与宿主细胞的相互作用,阐述HCV感染致病机制奠定基础。
材料与方法：
一、实验材料
1、质粒、菌株与细胞
在BamH1酶切位点插入全长573bp的HCV1b基因型C基因的重组质粒pCMH6K由日本金泽医科大学综合医学研究所王春福博士惠赠;感受态菌DH5α购自TaKaRa公司;CHO细胞购自中国科学院上海细胞库,生长于37℃、5％CO2及含有10％FCS的DMEM中。
2、主要试剂
小量质粒提取试剂盒:Axygen公司;DMEM(Code No.SH30022.01B):ThermoFisher生物制品北京有限公司生产;胎牛血清(CodeNo.TBD31HB):天津市灏洋生物制品科技有限责任公司生产;氨苄青霉素、脂质体(Lipofectamine2000)(Cat.No.11668-027)和G418:Invitrogen公司;小鼠的单克隆抗体HepC cAg(C7-50)(CodeNo.sc-57800):Santa公司;FITC标记的山羊抗小鼠IgG(Code No.ZF-0312):北京中杉金桥公司;BamHI、Total RNA提取试剂(CodeNo.D9108S)和RT-PCR试剂盒(CodeNo.DRR019A):TaKaRa公司。
3、引物
选自HCV C区序列:5-TTA GGA TCC ACG AAT CCT AAA CCT CAA A-3为上游引物,位于HCV C区第348-366nt位点;5’-ACT GAA TTC CCT CAT TGCCAT AGA GGG-3为下游引物,互补于HCV C区第592-610nt位点,由TaKaRa公司合成。采用RT-PCR方法检测pCMH6K稳定转染的不同时期CHO细胞中HCVCmRNA。
二、实验方法
1、pCMH6K转化与鉴定
将重组质粒pCMH6K转化到感受态菌DH50α中,通过含有氨苄青霉素的LB琼脂培养筛选出阳性菌落,接种于3ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,225rpm、37℃振荡培养过夜,参照小剂量质粒提取试剂盒说明书提取质粒,用BamHI酶切,1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2、pCMH6K瞬时转染CHO细胞及免疫荧光检测
37℃、5％CO2的条件下常规培养CHO细胞于6孔板中,24h细胞达到90％以上汇合,按照Lipofectamine2000说明书瞬时转染pCMH6K于CHO细胞,24h后,0.01MPBS洗细胞3次,4％多聚甲醛固定细胞1h,0.1％Triton-100溶液打孔10min,1％BSA封闭1h,加入小鼠的单克隆抗体HepC cAg(C7-50)(0.1％BSA1:100稀释)4℃孵育过夜,暗室中加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(0.1％BSA1:100稀释),37℃避光孵育1h,于荧光显微镜下观察细胞并拍照。
3、pCMH6K稳定转染CHO细胞获得稳定表达的阳性细胞株
确定本实验最佳G418筛选浓度:800mg/L。采用脂质体转染技术将pCMH6K转染CHO细胞,24h后用0.25％胰酶以1:4密度消化传代,继续培养24h,待细胞密度增至50-70％汇合时,加入800 mg/L G418浓度筛选培养基加压筛选2w,获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆,半量G418(400 mg/L)维持筛选培养扩大阳性克隆,继续传代培养110d以上,即得到稳定表达HCV C蛋白的阳性细胞株。
4、免疫荧光检测稳定转染细胞株中HCV C蛋白的表达
常规培养pCMH6K转染的CHO细胞,将其消化接种至6孔板中的盖玻片上,培养24h细胞密度达到80％以上时,0.01MPBS液洗涤细胞3次,4％多聚甲醛固定1h,O.1％Triton-100溶液打孔10min,1％BSA封闭1h,加入一抗HepC cAg(0.1％BSA稀释,稀释度1:100),4℃孵育过夜,暗室中加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(0.1％BSA稀释,稀释度1:100)37℃孵育1h,50％甘油封片,于荧光显微境下观察细胞并拍照。
5、RT-PCR检测稳定转染细胞株中HCV C基因的表达
将转染后不同时期细胞和未转染的细胞分别提取总RNA,以Random9为引物进行反转录;以5-TTA GGA TCC ACG AAT CCT AAA CCT CAA A-3为上游引物和5-ACT GAATTC CCT CAT TGC CAT AGA GGG-3为下游引物进行PCR扩增,以小鼠的管家基因GAPDH作为内参,PCR条件:94℃预变性2min;94℃变性30sec,55℃退火30see,72℃延伸1min,共35个循环;最后72℃延伸5min,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,确认PCR反应产物。
实验结果：
1、pCMH6K重组质粒的鉴定
提取pCMH6K经BamHI酶切、1％琼脂糖凝胶电泳分析,可见到约573bp的片段,与HCV1b基因型C蛋白编码基因大小相一致。
2、pCMH6K瞬时转染CHO细胞以及免疫荧光检测
转染pCMH6K的CHO细胞于24h可见较显著的绿色荧光标记,高倍视野可见绿色荧光标记主要分布在胞浆,也可见于胞膜,未转染pCMH6K的CHO细胞未见特异性绿色荧光标记,仅见散在的无特异性绿色荧光杂质。
3、pCMH6K稳定转染CHO细胞获得稳定表达的阳性细胞株
pCMH6K稳定转染后的CHO细胞于培养后48h加入G418,加压筛选2w,可见单个及小细胞团簇形成即阳性克隆出现,维持筛选第3d、6d、12d、15d可见细胞团簇逐渐扩大并融合;维持筛选后第35d、40 d、45d、50d、65d、85d、90d、95d、100d、105d以及110d等不同时期的细胞,可见细胞稳定生长,通过与同步传代的正常CHO细胞进行光镜下比较,二者在细胞形态上没有显著区别。
4、免疫荧光检测稳定转染细胞株中HCV C蛋白的表达
与未转染CHO细胞比较,稳定转染的CHO细胞可见较显著绿色荧光标记,主要分布在胞浆,也可见于胞膜,转染效率较瞬时转染大大提高,蛋白表达量明显增加。
5、RT-PCR检测稳定转染细胞株中HCV C基因的表达
反应产物经琼脂糖凝胶电泳可见特异性条带,反应产物大约267 bp,未转染细胞未见特异性条带,小鼠的管家基因GAPDH产物约168bp。
结论：
1、pCMH6K稳定转染的CHO细胞能够持续表达HCV C蛋白。
2、HCV C蛋白主要表达在胞浆,少部分表达在胞膜。