论文部分内容阅读
众所周知，纤维素是最廉价的可再生资源，它在全球上分布范围广、蕴藏量极其丰富，然而这种资源有很多不能被直接利用，从而成为了纤维素废物。纤维素酶虽然已经应用在工业上，但是纤维素酶的酶活力、最适温度、最适pH值、pH的稳定性能和热稳定性能等生物酶学指标仍然需要继续提高才能够满足工业生产需要。研究表明，61家族糖苷水解酶能够大大的提高纤维素酶的活性。 本研究从嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascus aurantiacus var.levisporus）中克隆出内切葡聚糖酶eg1基因和61f基因，嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）cbh1基因，通过融合PCR的方法，构建融合蛋白表达载体，与真核表达载体pPIC9K相连后，转化毕赤酵母GS115，筛选阳性克隆，甲醇诱导表达，纯化表达产物，测定纤维素酶活性及特性，与原始酶单独作用的酶活性做比较，筛选到纤维素酶活性最高的融合蛋白酵母工程菌株，命名为EG1-61F和61F-CBH1，这些菌株所表达的酶具有很好的热稳定性。EG1-61F产生的酶蛋白分子量为59kDa，最适温度为60℃，在80℃下保温60min后仍然剩下83％的酶活力，90℃的半衰期大约为50min，酶活性仍在56％左右，最适pH值为5.0，在pH4.0-6.0的条件下酶活力能够保持稳定。经纯化后测得蛋白含量1.43mg/ml，酶活为3.438U/mg。通过与原始酶61f和eg1（61f活性很微弱，eg1表现为内切酶活性）进行活性比较发现，融合体的酶活约为eg1酶活的2.1倍。 61F-CBH1酶蛋白分子量为102kDa，最适温度为60℃，60℃条件下处理60min后，残余酶活为96％，70℃处理60min后仍保持92％的活性，80℃处理50min后保持57％的活性，之后酶活迅速降低。最适pH值为6.0。通过与原始酶61f和cbh1（61f活性很微弱，cbh1表现为外切酶活性）进行活性比较发现，融合体的酶活约为cbh1酶活的1.5倍。