【摘 要】
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猪细小病毒（porcineparvovirus,PPV）能够导致母猪的繁殖障碍,给世界各国养猪业带来了巨大的经济损失。目前,针对PPV主要结构蛋白VP2和非结构蛋白NS1的研究很多,但针对PPV全基因
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猪细小病毒（porcineparvovirus,PPV）能够导致母猪的繁殖障碍,给世界各国养猪业带来了巨大的经济损失。目前,针对PPV主要结构蛋白VP2和非结构蛋白NS1的研究很多,但针对PPV全基因组的研究很少,GenBank中收录的完整的PPV全基因组序列只有两条（GenBankno.U44978和NC001718）,因此,本论文对实验室分离的两株猪细小病L毒X（B-PPV-20-06和LXB-PPV-16-06）进行全基因组序列测定,以分析这两株猪细小病毒基因组的分子特征,G并en结B合ank中收录的我国及国外的猪细小病毒序列,对猪细小病毒的遗传变异做一分析,并对LXB-PPV-20-06株主要的非结构蛋白NS1蛋白和结构蛋白VP2进行原核表达。通过设计涵盖PPV全基因组的7对引物,分段克隆PPV的基因组片段,将PCR鉴定为阳性的重组质粒送大连宝生物工程公司测序。结果表明LXB-PPV-20-06株和LXB-PPV-16-06株基因组全长分别为5013nt和5031nt,其编码区均不存在碱基的插入与缺失,但在VP1/VP2终止密码子处的非编码区存在不同程度的碱基缺失,分别缺少63nt和45nt,推测可能与毒力变化有关。NS1基因及编码蛋白的多序列比对表明LXB-PPV-20-06株与美国Kresse株和我国的NJ株同源性最高,均为99.4%,PPV-16-06株与我国的SY-99株同源性最高,只有一个氨基酸位点的差异;VP2基因及编码蛋白的多序列比对表明PPV-20-06株与Kresse株同源性最高,其编码氨基酸序列完全一致,LXB-PPV-16-06株与LJL-12株同源性最高。根据VP2蛋白的多序列比对结果以及VP2蛋白215位、378位、383位、436位和565位氨基酸位点的变异情况,发现PPV感染的临床病理型与VP2蛋白这些位点的变异情况密切相关。遗传进化分析表明,我国的猪细小病毒流行株毒在进化树上比较接近。通过PCR扩增LXB-PPV-20-06株NS1基因和VP2基因全序列,经酶切之后,克隆至pET-32a（+）载体上,经PCR、酶切鉴定,筛选重组表达质粒pET-NS1和pET-VP2,将阳性重组子送公司测序,经序列分析进一步验证重组子构建。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中,经总浓度为1mmol/LIPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示PPV-LXB-20-06株NS1基因和VP2基因均获得了良好的表达,用镍柱对融合蛋白进行纯化,融合表达的NS1蛋白的分子量接近97kDa,融合表达的VP2蛋白的分子量接近82kDa。Westernblot检测结果表明表达蛋白具有良好的抗原性,这为NS1蛋白和VP2蛋白在临床诊断中的应用奠定了基础。
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