肝细胞癌是造成人类死亡的重要恶性肿瘤之一，随着发病因素包括病毒感染、酗酒、肥胖等的增多，发病率逐年升高。肝癌细胞恶性度高，病情进展快，大多数患者发现既已晚期失去治疗机会，常规的治疗方法包括手术、放化疗、栓塞等都未取得较好的疗效。人们希望寻求一种新的治疗方法。近几年来肿瘤的免疫治疗得到了人们的重视，多种肝癌免疫治疗方案包括肿瘤细胞疫苗、细胞因子治疗、单克隆抗体治疗、以及免疫细胞过继治疗包括：树突状细胞、淋巴因子诱导的肿瘤杀伤细胞（CIK）、细胞因子激活的免疫细胞以及肿瘤免疫基因治疗等在实验室以及临床应用研究中取得一定进展。研究认为在肿瘤组织诱导有效的抗肿瘤免疫需要两个必要的因素：一是在肿瘤组织内建立“危险信号”，肿瘤细胞的死亡不仅提供免疫细胞识别的肿瘤抗原，也是肿瘤组织重要的危险信号，但这种免疫反应将会受到免疫调节细胞的调节，产生抗肿瘤的免疫抑制。因此需要第二因素即在肿瘤部位具有抗肿瘤的免疫增强信号，从而逆转肿瘤免疫调节细胞抑制的抗肿瘤免疫。而当前的肝癌免疫治疗方案不能同时满足上述两个因素，这可能是导致抗肿瘤免疫治疗效果不佳的因素之一。为实现在抗肝癌免疫治疗过程中同时满足上述两个因素，本研究拟通过如下方案进行研究：（1）应用亲水性琼脂糖包埋肿瘤细胞的方法进行肿瘤细胞的杀伤有学者研究已证明亲水性琼脂糖包埋的肿瘤细胞可以在琼脂糖包埋形成的巨珠内自调控生长，在自调控生长过程中分泌诱导自身细胞的凋亡物质，其分泌的物质也可诱导其他与之共培养细胞的死亡。因此通过方法，可使包埋肿瘤细胞不断释放肿瘤细胞杀伤物质，造成肿瘤细胞的不断死亡，提供免疫反应的危险信号。（2）应用包埋的细胞不断分泌抗肿瘤免疫因子来提供免疫增强信号本研究拟应用基因重组以及基因转移技术将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子转移到肿瘤细胞内，使该细胞稳定表达该因子。将该细胞进行包埋，在不断分泌肿瘤杀伤物质的同时，分泌人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。（3）考虑到将来巨珠移植带来的肿瘤种植问题，应用种属之间肿瘤的不可种植性，我们采用小鼠癌细胞来作为肿瘤杀伤物质分泌的种子细胞。同时为进一步调控细胞因子的分泌所带来的副作用，将自杀基因同时转入到该细胞，自杀基因在给予前体药物的情况下，杀伤巨珠内的肿瘤细胞，从而调控细胞的杀伤与免疫反应。针对上述研究思路本研究应用基因重组技术和基因转移技术建立稳定表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与单纯疱疹病毒基因（HSV-TK）的小鼠肝癌细胞，应用亲水性琼脂糖对基因修饰的小鼠肝癌细胞进行包埋培养，观察包埋细胞杀伤人肝癌细胞肿瘤与诱发抗肿瘤免疫的能力。（1）亲水性琼脂糖包埋的小鼠肝癌Hapa1-6细胞的培养上清具有抑制小鼠Hapa1-6细胞以及人肝癌细胞株HepG2生长作用。应用亲水性琼脂糖进行小鼠肝癌Hapa1-6细胞的包埋，形成细胞巨珠。收集3个包埋Hapa1-6细胞巨珠培养第3d、6d、12d、24d，35d培养上清，将培养上清作用于Hapa1-6与HepG2细胞，应用MTT法检测上清作用第3d、5d、7d细胞的活性，判定包埋细胞上清对上述两种细胞的抑制。结果显示包埋细胞的上清对两种细胞的生长均有抑制作用，其随着巨珠培养的时间而增强。将包埋细胞的巨珠与HepG2细胞共培养，显微镜下显示，共培养5天后出现细胞的死亡，进一步说明包埋细胞的培养上清具有抑制肿瘤细胞生长的作用。（2）建立稳定表达人GM-CSF与HSV-TK基因的小鼠肝癌细胞株应用重组技术分别构建人GM-CSF与HSV-TK基因的真核表达载体，两个载体分别具有不同的筛选标志。以小鼠肝癌细胞株Hapa1-6为研究模型，应用脂质体介导的基因转移技术，首先将人GM-CSF至Hapa1-6细胞，通过给予嘌呤霉素进行基因稳定表达细胞的筛选，针对筛选的克隆细胞应用RT-PCR技术进行基因转录水平表达的检测，应用ELISA方法进行细胞上清中GM-CSF含量检测。在建立人GM-CSF基因稳定表达细胞株基础上，将HSV-TK基因应用脂质体转移到该细胞，应用G418进行基因稳定表达细胞的筛选。筛选的克隆细胞应用RT-PCR技术进行HSV-TK基因转录水平表达的检测。给予前体药物GCV，观察细胞的死亡情况。实验结果显示人GM-CSF与HSV-TK基因在Hapa1-6细胞内稳定共同表达，给予GCV后，可以诱导细胞的死亡。从而建立稳定表达人GM-CSF与HSV-TK基因的小鼠肝癌细胞株。（3）亲水性琼脂糖包埋的稳定基因转染Hapa1-6细胞的培养上清具有抗人肝肿瘤的生物学研究将人GM-CSF与HSV-TK双基因表达小鼠肝癌细胞株分别应用亲水性琼脂糖包埋培养，分别收集培养不同时间的细胞培养上清，将这些上清与人肝癌细胞株进行共培养，通过MTT法测定对人肝癌细胞生长情况。结果研究显示包埋的细胞上清能够抑制人肝癌细胞株生长，其抑制程度随包埋细胞培养天数逐渐增加。（4）亲水性琼脂糖包埋的GM-CSF基因修饰的Hapa1-6细胞能够长期分泌GM-CSF蛋白。通过ELISA方法检测不同时间包埋的GM-CSF基因修饰的Hapa1-6细胞培养上清，结果显示在包埋细胞培养的3d-12d含量逐渐下降，而在12d-35d含量逐渐上升并稳定，说明通过该方法可以获得长期的细胞因子分泌以及不断免疫刺激。（5）自杀基因的前体药物能够杀伤亲水性琼脂糖包埋的细胞。将HSV-TK基因修饰的Hapa1-6细胞通过亲水性琼脂糖包埋培养后，给予自杀基因的前体药物，检测GM-CSF分泌变化。结果显示给予GCV（10ng/ml）后，培养包埋细胞巨珠分泌GM-CSF随时间不断下降，而未给予GCV的包埋细胞巨珠分泌GM-CSF未见显著变化。总之，上述研究在肿瘤细胞的死亡与肿瘤免疫活性因子共同存在可以诱发有效抗肿瘤免疫治疗的理论基础上，应用基因工程技术与细胞包埋技术相结合，初步探讨了肿瘤免疫治疗过程中肿瘤细胞死亡与肿瘤免疫活性因子分泌不能同时存在的问题的解决方案，为肝癌的免疫治疗提供新的途径。