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CD9蛋白广泛分布于血小板、前B细胞、单核细胞等造血细胞中,CD9还分布于骨髓细胞、脑细胞和肌肉细胞中,另外CD9还普遍在不同组织的干细胞表面表达,在卵母细胞中也有CD9表达。CD9相对分子质量为24 KD。分子中有4个疏水区,往返4次穿过细胞膜,与其它多种同源性膜蛋白共同组成“4次跨膜蛋白”(Tetraspanin)超家族。CD9被证明和细胞支持、细胞黏附、细胞运动、细胞增殖、细胞融合及肿瘤细胞的转移等有关,另外CD9也是精卵质膜相互作用中一种重要的蛋白。因此本实验拟通过构建CD9真核表达载体。利用逆转录病毒转染效率高,外源基因表达稳定等优点,在哺乳动物细胞中表达人CD9蛋白,为对CD9的进一步研究创造条件。本实验通过RT-PCR技术对人CD9基因的cDNA进行了扩增、克隆、序列测定和分析,再将cDNA插入逆转录病毒载体,获得重组质粒载体,经293GP包装细胞包装成假病毒后转染目的细胞SP2/0,取得如下结果:1.RT-PCR方法扩增人CD9 cDNA将人ES细胞在DMEM培养基培养至细胞数达到107左右,Trizol提取细胞总RNA,紫外定量后,取适量进行RT-PCR,PCR产物琼脂糖凝胶电泳,结果显示PCR获得了目的大小片段。2.CD9 cDNA序列测定及分析PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后与pGEM-T载体进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,从转化的平板上挑取克隆,质粒提取试剂盒提取质粒,鉴定后测序。测序结果与NCBI上登录的人CD9基因序列完全一致。3.重组逆转录病毒质粒载体的构建T-CD9重组质粒经双酶切,回收CD9 cDNA片段,逆转录病毒质粒载体pBabe puro也用双酶切使之线性化,将线性化的pBabe puro与CD9片段用T4 DNA连接酶连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,从转化的平板上挑取克隆,酶切鉴定,证明逆转录病毒质粒载体pBabe pur-CD9构建成功。4.重组逆转录病毒的包装用DMEM培养基培养293GP细胞达60%-70%融合时,将重组质粒pBabe puro及pVSVG用磷酸钙转染法转入293GP包装细胞中,转染48h后,收集含假病毒颗粒的培养上清液转染SP2/0细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞。5.人CD9蛋白在重组细胞中的表达分别采用RT-PCR法、WESTERN杂交法、流式细胞仪法检测重组细胞中CD9表达情况,经检测CD9基因在SP2/0重组细胞中正常表达。