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目的高危型人乳头瘤病毒基因整合到人宫颈上皮细胞染色体后,原癌基因E6、E7及所表达的原癌蛋白在宫颈癌的发生和发展过程中起重要的作用。E6、E7蛋白分别与细胞周期调节因子P53、pRb相互作用,干预细胞周期进程导致肿瘤的发生。因而E6、E7成为HPV阳性宫颈癌基因治疗的理想靶标。RNAi作为一种用于基因功能和基因治疗研究的工具,具有特异性高、稳定性好、抑制作用强、细胞摄取容易等优点,已广泛应用于病毒基因功能及基因治疗研究。本实验借助化学合成的特异HPV16 E6基因的siRNA作用于HPV16表达阳性的人宫颈鳞癌SiHa细胞株,观察E6基因表达的特异性沉默情况;检测该siRNA能否同时抑制E7基因的表达,即是否可引起E6、E7基因表达的共抑制;进一步探讨RNAi对SiHa细胞在分子水平上所产生的一系列影响。为深入认识宫颈癌的发病机制提供理论依据,同时也为RNAi技术用于治疗HPV感染及宫颈癌提供实验基础。方法(1)按照siRNA设计原则,设计HPV16 E6基因特异性siRNA,序列经BLAST进行同源性分析,确保与人类基因编码序列无同源性。(2)借助脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将siRNA转入SiHa细胞。(3)转染后24h、48h、72h三个时间点分别提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6、E7 mRNA的表达情况;转染后72h提取细胞内总蛋白,WesternBlot检测P53、pRb、VEGF-C、Survivin蛋白的表达情况。RT-PCR扩增条带与蛋白质条带均用分析软件进行灰度分析。结果(1)半定量RT-PCR结果显示转染特异性HPV16 E6 siRNA后24h、48h、72h细胞内E6 mRNA的相对表达量与脂质体对照组相比分别减少了65.5%、62.7%、59.5%,P＜0.05;E7 mRNA的相对表达量与脂质体对照组相比分别减少了63.9%、67.1%、58.3%,P＜0.05。(2)Western Blot检测转染72h后的细胞内P53、pRb、VEGF-C和Survivin蛋白的表达情况,与脂质体对照组相比P53蛋白的表达增加了108.4%,P＜0.05;pRb蛋白的表达增加了76.5%,P＜0.05;VEGF-C的表达减少了28.7%,P＜0.05;实验组Survivin蛋白的表达情况与脂质体对照组相比差异无统计学意义,P＞0.05。结论(1)本实验设计的特异性HPV16 E6 siRNA在转染入SiHa细胞后,能同时部分沉默HPV16 E6和E7基因的表达。(2)细胞内E6和E7基因表达的抑制引起P53和pRb蛋白表达的增加以及VEGF-C蛋白表达的减少,而Survivin蛋白的表达则没有发生变化。