第一部分体外大鼠器官型中脑脑片培养模型的建立目的:建立体外大鼠长期器官型中脑脑片培养模型,为下一步药物干预研究作准备。方法:采用液气双相界面培养法,取出生10-28天的Wistar大鼠中脑切片应用Millicell微孔膜培养插件培养10-30天,培养过程中通过镜下观察及测定LDH释放量来检测中脑脑片活性,HE及TH免疫组织化学染色观察脑片细胞状态。结果:镜下观察脑片培养10-21天内能正常生长,21天以后脑片活性下降并逐渐死亡;LDH检测结果显示5-7天后脑片培养趋于稳定;HE及TH免疫组织化学染色显示脑片结构清晰,黑质细胞显示良好。结论:7-21天内脑片生长良好,成功建立了体外大鼠长期器官型中脑脑片培养模型。第二部分蛋白酶体抑制剂对中脑脑片的毒性作用及其机制研究目的:利用已建立的中脑脑片培养模型观察蛋白酶体抑制剂Lactacystin对脑片及黑质细胞的毒性作用并初步探讨其机制。方法:对稳定培养并生长良好的脑片分组,分别加入Lactacystin0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L作用24小时,测定培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活力水平,TH免疫组化观察黑质细胞变性缺失,α-synuclein免疫组化检测脑片α-synuclein表达,TUNEL法检测黑质细胞凋亡。结果:经蛋白酶体抑制剂Lactacystin处理后,脑片活性下降;与对照组比较脑片黑质部位TH阳性神经元数量减少(P<0.05),α-synuclein表达增加(P<0.05), 0.5μmol/L、1.0μmol/L和5.0μmol/L的Lactacystin处理组TUNEL染色阳性率明显增加(P<0.05)。结论:蛋白酶体抑制剂Lactacystin对脑片具有特异性毒性作用,导致黑质部位DA能神经细胞缺失,诱导黑质细胞凋亡,其作用具有浓度依赖性。其机制可能与增加α-Synuclein的异常聚集有关。蛋白酶体功能缺陷在帕金森病发病机制中可能发挥重要作用。